Resumo
O processo de replicação do DNA em eucariontes inicia-se com o reconhecimento de uma origem de replicação por proteínas denominadas ORC (Origin Replication Complex). Esse complexo é formado por seis proteínas (ORC1-6) e, uma vez associado ao DNA, recruta a molécula CDC6 que, por sua vez, recruta, juntamente com fatores adicionais, o complexo MCM com atividade de helicase, fundamental tanto para a replicação do DNA quanto para o controle de uma única replicação por ciclo celular. Dentre os eucariontes, as sequências de DNA reconhecidas por ORCs só estão bem definidas em leveduras. Nos demais organismos, incluindo trypanosomas, não são conhecidas as sequências responsáveis pelo início da síntese de DNA. Os trypanosomas são parasitas primitivos que divergiram muito cedo da linhagem eucarionte. Esse fato coloca os trypanosomas como organismos que devem apresentar características moleculares e mecanísticas de um ancestral comum. De fato, uma análise do genoma de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei mostrou que diferentemente dos demais eucariontes, mas exatamente como em Archea, esses organismos não contêm genes para ORCs, mas apresentam uma única ORF que codificaria para uma proteína homóloga tanto a ORC1 quanto a CDC6 (ORC1/CDC6). É possível que esta proteína seja responsável, assim como é em Archea, pelo reconhecimento das origens de replicação nesses organismos. Uma vez que o genoma de T. cruzi, T. brucei e também L. major estão completos, este projeto pretende estabelecer uma nova linha de pesquisa pós-genômica relacionada ao controle da replicação desses protozoários. Assim, os objetivos deste trabalho são identificar as origens de replicação em trypanosomas, localizar essas origens no núcleo durante o ciclo celular e definir os componentes responsáveis pelo controle do início de replicação nestes organismos. Para a identificação das sequências de DNA que se associam a ORC1l/CDC6 em trypanosomas, serão gerados anticorpos policlonais anti-ORC1/CDC6 que serão utilizados em ensaio de imunoprecipitação de cromatina. Os fragmentos de DNA imunoprecipitados serão marcados e utilizados como sonda em ensaios de array para determinação das sequências que compõem as origens de replicação. Essas regiões de início de replicação serão confirmadas por meio de géis bidimensionais que permitem a visualização de forquilhas de replicação. A associação dessas origens de replicação à ORC1/CDC6 será confirmada por meio de ensaio de gel shift. Para avaliar a localização nuclear das origens de replicação será realizado ensaio de hibridização in situ fluorescente (Fish) com sondas específicas em parasitas em diferentes fases do ciclo celular. Essas amostras serão também submetidas a ensaios de imunofluorescência, utilizando-se anticorpos anti-ORC1/CDC6 para localização nuclear da maquinaria de replicação. Mais do que isso, ensaios conjuntos de Fish e imunofluorescência esclarecerão o momento do ciclo celular e a localização nuclear onde ORC1/CDC6 se associa às origens de replicação. Estes dados fornecerão as bases moleculares e celulares da proliferação celular nesses organismos, o que não só enriquecerá substancialmente o conhecimento da biologia do Trypanosoma, como também abrirá novas perspectivas para o controle desses parasitas. (AU)
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