Caracterização do envolvimento do citoesqueleto no efeito antinociceptivo da crotalfina: ensaios in vivo e in vitro

• Processo: 12/10105-1
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2012
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2015
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Geral
• Pesquisador responsável: Yara Cury
• Beneficiário: Yara Cury
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Crotalfina Citoesqueleto Receptores opioides Prostaglandinas Analgésicos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Antinocicepção | Citoesqueleto | crotalfina | Prostaglandina E2 | Receptores opióides | Dor e Analgesia

Resumo

A crotalfina é um peptídeo presente no veneno da serpente Crotalus durissus terrificus, que apresenta potente atividade antinociceptiva mediada pela ativação de receptores opióides do tipo kappa e delta. A antinocicepção induzida pela crotalfina é de longa duração e observada em modelo de hiperalgesia inflamatória, dor neuropática e dor de câncer. Estudos recentes mostraram que a ativação da via L-arginina/NO/GMPc, com consequente abertura de canais de K+ sensíveis a ATP, que ocorre após a ativação dos receptores opióides, medeia o efeito da crotalfina. Os estudos mostraram ainda que a crotalfina libera opióides endógenos e que estes peptídeos são os responsáveis pela ação opioidérgica da crotalfina. Foi observado também, em estudos in vitro, que a crotalfina ativa MAP quinases e PKCzeta. O citoesqueleto é um elemento fundamental na sinalização celular, e está intimamente envolvido com a sinalização nociceptiva e antinociceptiva, embora esses mecanismos não estejam completamente esclarecidos. O citoesqueleto é uma rede filamentosa de F-actina, microtúbulos e filamentos intermediários, composta por uma de três subunidades quimicamente distintas, actina, tubulina ou uma das diversas classes de proteínas de filamentos intermediários. Além disso, uma variedade de proteínas acessórias atua junto ao citoesqueleto regulando sua ativação e consequentemente seu efeito sobre outras proteínas envolvidas na sinalização celular. O objetivo desse trabalho é compreender melhor o mecanismo molecular da ação da crotalfina, especificamente no que diz respeito à relevância do citoesqueleto para a atividade farmacológica da crotalfina. Dados iniciais mostraram, em ensaios comportamentais de avaliação de dor utilizando agentes desestabilizadores do citoesqueleto, que filamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários são fundamentais para a atividade antinociceptiva da crotalfina. Apesar desses dados, não foi ainda caracterizado como ocorre a interação entre a crotalfina e o citoesqueleto e como os componentes do citoesqueleto podem influenciar a ação da crotalfina. Assim o objetivo deste projeto é avaliar o papel do citoesqueleto sobre o mecanismo molecular de ação da crotalfina, no que se refere à expressão/ativação de receptores opióides e à liberação de opióides endógenos, assim como avaliar o efeito da crotalfina sobre a organização do citoesqueleto. Para isso serão utilizados inibidores específicos de microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários associados à crotalfina. Os objetivos específicos são: (1) avaliar, por meio de ensaios de imunohistoquímica utilizando nervo plantar e gânglios da raiz dorsal de animais tratados, se a crotalfina, na ausência ou vigência de sensibilização por PGE2 interfere com a organização de microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários; (2) investigar em gânglios da raiz dorsal, obtidos de animais tratados com crotalfina, na vigência ou ausência de sensibilização por PGE2, utilizando técnicas de PCR em Tempo Real e western blot, o efeito da crotalfina sobre a expressão gênica e proteica de proteínas acessórias do citoesqueleto; (3) investigar, por meio de ensaios de imunohistoquímica, a importância da estabilidade de microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários sobre o padrão de expressão dos receptores opióides mu, kappa e delta no nervo plantar e gânglios da raiz dorsal de animais tratados com crotalfina, na presença ou ausência de sensibilização por PGE2; (4) investigar, por meio de ensaios de ELISA, o efeito da inibição farmacológica de filamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários sobre a liberação de peptídeos opióides endógenos promovida pela crotalfina, na presença ou ausência de sensibilização por PGE2. (AU)