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Determinação dos parâmetros cinéticos dos transportadores de glicose hxtBp, hxtCp e hxtEp de Aspergillus nidulans

Resumo

Em fungos filamentosos poucos elementos relacionados com o sensoriamento e transporte de glicose estão caracterizados funcionalmente. Em trabalhos em curso no laboratório identificámos quatro homólogos de sensores de glicose em A. nidulans denominados hxtB, hxtC, hxtD e hxtE, com base nos homólogos Snf3 e rgt2 de S. cerevisiae. A obtenção de mutantes deletados para HXTB, HXTC, HXTD e HXTE permitiu a caracterização fenotípica das cepas geradas bem como avaliar a sua capacidade de complementar funcionalmente uma cepa de S. cerevisiae incapaz de crescer em glicose como única fonte de carbono e energia por ausência dos respectivos sistemas de transporte deste açúcar. Os experimentos de complementação funcional permitiram concluir que as proteínas codificadas pelos genes HXTB, HXTC e HXTE são transportadores de glicose funcionalmente competentes em S. cerevisiae. No sentido de aprofundar as cinéticas de transporte associadas às proteínas hxtBp, hxtCp e hxtEp, com a determinação dos parâmetros cinéticos afinidade, especificidade e velocidade máxima, propõe-se expressar os correspondentes genes na cepa EBY.VW4000 de S. cerevisiae, funcionando como cleanroom, e determinar estes parâmetros. Para tal serão realizados experimentos de uptake nas cepas transformantes utilizando glicose marcada radioativamente. A acumulação de radioativo para os tempos de 10 e 15 segundos será utilizada para determinar a velocidade inicial para cada concentração de glicose testada. Serão, naturalmente avaliadas concentrações altas e baixas de glicose para a determinação dos parâmetros cinéticos e outros açucares serão testados como inibidores competitivos, determinando assim a especificidade de cada um dos sistemas de transporte. (AU)

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