Determinação dos parâmetros cinéticos dos transportadores de glicose hxtBp, hxtCp e hxtEp de Aspergillus nidulans

• Processo: 12/23922-8
• Linha de fomento: Auxílio à Pesquisa - Pesquisador Visitante - Internacional
• Vigência: 23 de fevereiro de 2013 - 22 de março de 2013
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Gustavo Henrique Goldman
• Beneficiário: Gustavo Henrique Goldman
• Pesquisador visitante: Fernando José dos Santos Rodrigues
• Inst. do pesquisador visitante: Universidade do Minho (UMinho), Portugal
• Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 08/56254-2 - Functional analysis of the transcription factor XINR involved in regulation of transcription of cellulases - and hemicellulases-enconding genes in Aspergillus niger, AP.BIOEN.TEM
• Assunto(s): Biologia molecular Saccharomyces cerevisiae Glicose

Resumo

Em fungos filamentosos poucos elementos relacionados com o sensoriamento e transporte de glicose estão caracterizados funcionalmente. Em trabalhos em curso no laboratório identificámos quatro homólogos de sensores de glicose em A. nidulans denominados hxtB, hxtC, hxtD e hxtE, com base nos homólogos Snf3 e rgt2 de S. cerevisiae. A obtenção de mutantes deletados para HXTB, HXTC, HXTD e HXTE permitiu a caracterização fenotípica das cepas geradas bem como avaliar a sua capacidade de complementar funcionalmente uma cepa de S. cerevisiae incapaz de crescer em glicose como única fonte de carbono e energia por ausência dos respectivos sistemas de transporte deste açúcar. Os experimentos de complementação funcional permitiram concluir que as proteínas codificadas pelos genes HXTB, HXTC e HXTE são transportadores de glicose funcionalmente competentes em S. cerevisiae. No sentido de aprofundar as cinéticas de transporte associadas às proteínas hxtBp, hxtCp e hxtEp, com a determinação dos parâmetros cinéticos afinidade, especificidade e velocidade máxima, propõe-se expressar os correspondentes genes na cepa EBY.VW4000 de S. cerevisiae, funcionando como cleanroom, e determinar estes parâmetros. Para tal serão realizados experimentos de uptake nas cepas transformantes utilizando glicose marcada radioativamente. A acumulação de radioativo para os tempos de 10 e 15 segundos será utilizada para determinar a velocidade inicial para cada concentração de glicose testada. Serão, naturalmente avaliadas concentrações altas e baixas de glicose para a determinação dos parâmetros cinéticos e outros açucares serão testados como inibidores competitivos, determinando assim a especificidade de cada um dos sistemas de transporte. (AU)