Effects of long-term in vitro culturing of transgenic bovine donor fibroblasts on cell viability and in vitro developmental potential after nuclear transfer

• Processo: 13/06943-4
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2013
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2013
• Área do conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
• Pesquisador responsável: Flávio Vieira Meirelles
• Beneficiário: Flávio Vieira Meirelles
• Instituição Sede: Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA). Universidade de São Paulo (USP). Pirassununga , SP, Brasil
• Assunto(s): Biotecnologia da reprodução
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Developmental Biology | nuclear transfer | transgenesis | biotecnologia da reprodução

Resumo

Animais geneticamente modificados apresentam inúmeras aplicações, que compreendem desde a pesquisa básica até a produção animal e agricultura. O progresso recente na clonagem animal por transferência de núcleo (TN) possibilitou a produção de animals de produção transgênicos utilizando linhagens celulares previamente modificadas geneticamente. Porém para a produção de tais linhagens, um tempo adicional de cultivo in vitro e uma maior manipulação é necessária. Neste estudo é objetivada a caracterização de diversos aspectos de células geneticamente modificadas quando comparadas a células controle, além de analisar a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos por TN com a utilização destas células como doadoras de núcleo após um período curto ou longo cultivo in vitro (passagens baixas versus passagens altas). A hipótese foi a de que o material genético inserido no genoma destas células, associado ao tempo prolongado em cultivo, altera a fisiologia e a viabilidade celulares, resultando no potencial de reprogramação nuclear diminuída e na consequente redução de produção de blastocistos. Fibroblastos fetais expressando a Proteína Fluorescente Verde (eGFP) cultivados por diferentes períodos foram analisados quanto às anormalidades numéricas cromossomais, fragmentação de DNA nuclear, razão de Bax/Bcl2, e intensidade do potencial de membrana mitocondrial, e foram utilizadas como doadoras de núcleo na TN. Padssagens baixas foram definidas como menores de 11 passagens, e passagens altas entre a 18a e 21a passagem. Não foram encontradas diferenças na porcentagem de células com anormalidades cromossomais ou na análise do potencial de membrana mitocondrial. Células eGFP em passagens altas e células controle em passagens baixas não foram diferentes quanto à fragmentação de DNA, porém, células controle em passagens altas apresentaram alta fragmentação (P<0,05). A razão da expressão entre Bax e Bcl2 em células controle e transgênicas apresentaram padrões diferentes quanto às condições durante o cultivo. Nos experimentos de TN, não foi observada diferenças entre os grupos reconstruídos com células de passagens baixas ou altas quando as taxas de fusão (63,1% e 49%), clivagem (67,7 e 69,9%), embriões em 8 células (36,4% e 44,4%) e a blastocisto (21,6% e 20.8%) foram cpmparadas Em conclusão, o comportamento do cultivo foi diferente entre as células controle e eGFP. Porém, fibroblastos cultivados por longos períodos in vitro permaneceram competentes para a produção embrionária por TN, uma característica necessária para experimentos envolvendo a manipulação genética de cultivos celulares que visam a produção de animais transgenicos. (AU)