Analysis of the Enzymatic Activity of an NS3 Helicase Genotype 3a Variant Sequence Obtained From a Relapse Patient

• Processo: 15/25933-5
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2016
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2016
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia
• Pesquisador responsável: Paola Jocelan Scarin Provazzi
• Beneficiário: Paola Jocelan Scarin Provazzi
• Instituição Sede: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de São José do Rio Preto. São José do Rio Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Virologia Vírus da hepatite C
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Hcv | HCV Helicase | hepatitis C virus | NS3 Helicase | Virologia

Resumo

O vírus da Hepatite C (HCV) é o principal agente causador das Hepatites Não-A e Não-B. A estimativa global da prevalência da infecção pelo HCV é de 2,2%, correspondendo a 130 milhões de pessoas HCV positivas no mundo. O genótipo 3a do HCV é comum no Brasil, e está associado a uma resposta menos efetiva para as terapias atuais envolvendo antivirais de ação direta. A proteína NS3 do HCV cliva parte da poliproteína do vírus, assim como proteínas celulares antivirais. Portanto, trata-se de um potencial alvo para o desenvolvimento de novos fármacos contra o HCV. Além da sua atividade protease, a NS3 também desempenha a função de helicase. Em um estudo prévio, foi identificada, em um paciente que apresentou recidiva do vírus após tratamento, a mutação W501R na sequência codificadora da proteína NS3 do HCV do genótipo 3. A mutação pontual W501R, conhecida por ser letal para o HCV genótipo 1b, codifica a substituição de aminoácidos no sítio de ligação da helicase ao RNA. Para avaliar o modo como a substituição W501R afeta a atividade da helicase, as proteínas de tipo selvagem e W501R mutadas foram sub-clonadas, expressas em E. coli e as proteínas recombinantes foram purificadas e caracterizadas. Ensaios monitorando o desenovelamento do RNA e DNA, catalizado pela helicase, revelou que a eficiência catalítica da proteína em sua forma selvagem foi mais de 600 vezes maior do que a proteína W501R. Outros ensaios revelaram que a proteína W501R ligou-se de forma mais fraca ao DNA que a proteína NS3 helicase selvagem, e ambas as formas hidrolizaram o ATP em taxas semelhantes. Em células Huh7.5, tanto os replicons subgenômicos do HCV dos genótipo 2a e 3a, portadoras do alelo W501R, mostraram um defeito grave na replicação do vírus. Uma vez que o alelo W501R é carregado como uma variante menor, a sua replicação no paciente pode ser atribuída à atividade de trans-complementação realizada por outras variantes virais tipo selvagem. (AU)