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Análise do efeito fenotípico de SNPs situados no locus Irm1 que regula a produção de IL-1beta em camundongos

Processo: 16/07007-9
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de novembro de 2016 - 30 de abril de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Imunologia - Imunogenética
Pesquisador responsável:Olga Celia Martinez Ibanez
Beneficiário:Olga Celia Martinez Ibanez
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Pesq. associados:Andrea Borrego ; Geraldo Santana Magalhães ; José Ricardo Jensen ; Marcelo de Franco ; Nancy Starobinas ; Orlando Garcia Ribeiro Filho ; Wafa Hanna Koury Cabrera
Auxílios(s) vinculado(s):17/50407-0 - High density genome wide genotyping on a pedigree of AIRmin and AIRmax mice to map and characterize new loci involved in lung and intestinal tumour development, AP.R
Bolsa(s) vinculada(s):17/26532-0 - Análise do efeito fenotípico de SNPs situados no locus Irm1 que regula a produção de IL-1beta em camundongos, BP.TT
Assunto(s):Inflamação  SNP  Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas  Proteína 9 associada à CRISPR 

Resumo

Linhagens de camundongos bons (AIRmax) e maus (AIRmin) respondedores selecionadas fenotipicamente por cerca de 70 gerações, com base na intensidade da resposta inflamatória aguda (AIR), têm sido empregadas para o estudo do controle genético desta reação da imunidade inata. Ensaios de linkage usando marcadores de polimorfismo de base única (SNP) e o fenótipo de síntese quantitativa de IL-1beta por ativação do inflamassomo, foram realizados em grande população heterogênea de animais F2(AIRmax x AIRmin), resultante do intercruzamento das duas linhagens. Sinal de linkage altamente significante (LOD score=72) entre SNPs e fenótipo delimitou uma região de cerca de 3,5 Mb na região distal do cromossomo 7, a qual denominamos locus Irm1. Após sequenciamento genômico desta região em grupos de animais com fenótipos extremos de alta e baixa resposta, o intervalo ficou reduzido para 450 Kb, contendo 14 SNPs. Um destes localiza-se em exon do gene Pycard, cujo produto é um elemento central dos complexos de inflamassomos envolvidos na síntese da IL-1beta; outros SNPs situam-se em introns de genes de integrinas e de reguladores de sinalização de proteínas G e outros em regiões não gênicas. Em vista do alto grau de significância estatística conseguida com os ensaios de linkage, da precisão do mapeamento do locus Irm1 e do reduzido número de SNPs identificados, justifica-se a pesquisa para uma comprovação funcional destas variantes genéticas sobre fenótipos inflamatórios que diferenciam as linhagens AIRmax e AIRmin. Neste projeto pretendemos empregar a tecnologia CRISPR/Cas9 de edição gênica, para investigar a função destes polimorfismos sobre os níveis de produção de IL-1beta, em ensaios in vitro com linhagem de macrófagos murinos que secretam a citocina por ativação do complexo inflamassomo. A técnica permite a geração de alelos com mutações precisas para ensaios funcionais, visando estabelecer ligações causais entre variações genéticas e fenótipos biológicos. O método tem sido amplamente usado para interrogar o efeito de mutações pontuais na função do gene, adequando-se, portanto, perfeitamente ao principal objetivo deste projeto. (AU)