Resumo
O objetivo de nosso trabalho é avaliar, no tratamento crônico com glicose, a interação da PKA com diferentes sítios de fosforização do SGLT1 modulando a localização do co-transportador e indiretamente a atividade dos trocadores Na+/H+. Inicialmente, pretendemos obter o cDNA do hSGLTI wild type de células HEK-293 (human embrionic kidney cells -clone 293), pela técnica de RT-PCR. O produto de PCR do hSGLTI wild type será submetido a mutações no sitio da PKA. Em seguida, os cDNAs de hSGLTI wild type ou mutantes serão inseridos no vetor de clonagem p-GEM-T-easy, para amplificar a concentração de cDNA. Posteriormente, cada recombinante será clivado com as enzimas de restrição Hind III e Xho1 e clonado no vetor de expressão pEGFP-N1, o qual é fluorescente. Após o seqüenciamento dos ácidos nucléicos, os recombinantes de hSGLTI wild type ou mutantes serão transfectados em células MDCK (Mardin-Darbie Canine Kidney cells) que possuem NHE1 endógeno ou OK (opossum kidney epithelial cells) que possuem NHE3 endógeno e os clones positivos serão selecionados por fluorescência direta através de microscópio confocal. A atividade do NHE1 e NHE3 será avaliada por medidas de pHi através de microscopia de fluorescência, na situação controle (glicose 5 mM), no tratamento crônico com glicose (25 mM por 20 dias) ou na vigência de florizina (inibidor do SGLT1; 100 M, H-89 (inibidor da PKA, 10-6 M) e sucrose (inibidor da via da clatrina, 0,45 M). Por western blot, será avaliada a expressão do hSGLTI, NHE1, NHE3 e do receptor sensível a glicose Gpr1, na situação controle, no tratamento crônico com glicose ou na vigência de sucrose. Por imunofluorescência, será avaliada a localização celular do SGLT1 e do Gpr1, na situação controle, no tratamento crônico com glicose, na vigência de H-89 ou sucrose. (AU)
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