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No tratamento cronico com glicose diferentes sitios de fosforilacao para pka modulam a localizacao do sglt1 e indiretamente a recuperacao do phi.

Processo: 08/57647-8
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de março de 2009
Vigência (Término): 29 de fevereiro de 2012
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Fisiologia - Fisiologia de Órgãos e Sistemas
Pesquisador responsável:Maria Oliveira de Souza
Beneficiário:Olivia Beloto da Silva
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil

Resumo

O objetivo de nosso trabalho é avaliar, no tratamento crônico com glicose, a interação da PKA com diferentes sítios de fosforização do SGLT1 modulando a localização do co-transportador e indiretamente a atividade dos trocadores Na+/H+. Inicialmente, pretendemos obter o cDNA do hSGLTI wild type de células HEK-293 (human embrionic kidney cells -clone 293), pela técnica de RT-PCR. O produto de PCR do hSGLTI wild type será submetido a mutações no sitio da PKA. Em seguida, os cDNAs de hSGLTI wild type ou mutantes serão inseridos no vetor de clonagem p-GEM-T-easy, para amplificar a concentração de cDNA. Posteriormente, cada recombinante será clivado com as enzimas de restrição Hind III e Xho1 e clonado no vetor de expressão pEGFP-N1, o qual é fluorescente. Após o seqüenciamento dos ácidos nucléicos, os recombinantes de hSGLTI wild type ou mutantes serão transfectados em células MDCK (Mardin-Darbie Canine Kidney cells) que possuem NHE1 endógeno ou OK (opossum kidney epithelial cells) que possuem NHE3 endógeno e os clones positivos serão selecionados por fluorescência direta através de microscópio confocal. A atividade do NHE1 e NHE3 será avaliada por medidas de pHi através de microscopia de fluorescência, na situação controle (glicose 5 mM), no tratamento crônico com glicose (25 mM por 20 dias) ou na vigência de florizina (inibidor do SGLT1; 100 M, H-89 (inibidor da PKA, 10-6 M) e sucrose (inibidor da via da clatrina, 0,45 M). Por western blot, será avaliada a expressão do hSGLTI, NHE1, NHE3 e do receptor sensível a glicose Gpr1, na situação controle, no tratamento crônico com glicose ou na vigência de sucrose. Por imunofluorescência, será avaliada a localização celular do SGLT1 e do Gpr1, na situação controle, no tratamento crônico com glicose, na vigência de H-89 ou sucrose. (AU)

Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
SILVA, Olivia Beloto da. A PKA modula a localização do SGLT1 e indiretamente a recuperação do pHi, no tratamento com alta concentração de glicose.. 2012. Tese de Doutorado - Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas São Paulo.

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