Avaliação do perfil de expressão gênica em grande escala de células-tronco da polpa e de odontoblastos utilizando cDNA microarrays

• Processo: 09/01888-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2009
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2010
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular
• Pesquisador responsável: Karina Fittipaldi Bombonato Prado
• Beneficiário: Maidy Rehder Wimmers Ferreira
• Instituição Sede: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Células-tronco Polpa dentária Expressão gênica Odontoblastos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: cDNA microarrays | Células-tronco | expressão gênica | odontoblasto | Polpa | Cultura de Células

Resumo

O extraordinário potencial regenerativo do complexo dentino-pulpar enfatiza a importância da caracterização dos processos celulares e moleculares envolvidos na regeneração dentinária. Atualmente acredita-se que células-tronco da polpa são as responsáveis por esta regeneração, tornando a terapia com células-tronco uma promessa na reconstrução e substituição de elementos dentários ausentes devido a uma série de patologias. A investigação da expressão gênica de células indiferenciadas e de células com o fenótipo odontoblástico pode determinar papéis funcionais fundamentais de genes relevantes e aplicáveis neste tipo de terapia. Este estudo pode ser feito através do cDNA microarray, um método que pode quantificar milhares de sequências gênicas em um único experimento. O presente projeto visa a utilização desta técnica para apontar genes associados com a diferenciação odontoblástica. DESCRIÇÃO DOS OBJETIVOS Será realizada uma análise comparativa de expressão gênica em larga escala (transcriptoma) de células-tronco da polpa dentária e de células diferenciadas em odontoblastos (linhagens originárias de camundongos). Pretendemos apontar genes candidatos ao controle da diferenciação de células-tronco em odontoblastos. Além do cDNA microarray, serão efetuados experimentos para comprovação do fenótipo odontoblástico (avaliação adesão, proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total, atividade de fosfatase alcalina, formação de nódulos de mineralização e detecção de proteínas essenciais para a função dos odontoblastos através de microscopia de imunofluorescência indireta). PLANO DE TRABALHO Metodologia Células-tronco da polpa dentária de camundongos (OD-21) de linhagem odontoblástica de camundongos (MDPC-23) serão cultivadas em garrafas de cultura de 75 cm3 com 10 ml de meio de cultura D-MEM, 10% de soro fetal bovino e 2,75ml de penicilina-streptomicina. Nas células MDPC-23, serão adicionados 50 mg de ácido ascórbico para promover a formação de colágeno e matriz extracelular (Franceschi e cols., 1994) e 2mM de beta-glicerofosfato para obtermos a formação e mineralização de nódulos em multicamada (Tenenbaum, 1981). Durante todo o tempo de cultivo as células serão mantidas a 37oC em atmosfera umidificada, contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico e os meios serão trocados a cada dois dias. Após a confluência, as células serão removidas dos frascos de cultura por meio de EDTA 1mM (Gibco) e tripsina 0,25% (Gibco) e contadas utilizando um hemocitômetro (Fisher Scientific). Após o plaqueamento das células em placas de 24 poços a uma densidade de 10.000 células/poço (N=5), avaliaremos o fenótipo odontoblástico através de adesão (24 horas de cultura), proliferação e viabilidade celular, quantificação de proteínas totais e atividade de fosfatase alcalina (3, 7 , 10 e 14 dias de cultura), detecção e quantificação de matriz mineralizada (14 dias de cultura), imunolocalização das proteínas sialofosfoproteína dentinária (DSPP), fosfatase alcalina (ALP) e osteopontina (OPN) (24 horas e 3 dias de cultura). Para realizar os experimentos de cDNA microarray, as células serão colocadas em garrafas de cultura de 75 cm3 e após a confluência, serão submetidas à extração de RNA com kits específicos e as amostras serão processadas para obtenção do perfil de expressão gênica das duas linhagens celulares. Todos os experimentos serão realizados em triplicata. (AU)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

FERREIRA, Maidy Rehder Wimmers. Avaliação do perfil de expressão gênica em grande escala de células indiferenciadas da polpa e de células odontoblásticas utilizando cDNA microarray. 2011. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (PCARP/BC) Ribeirão Preto.