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Caracterização molecular do poliomavírus humano JC em pacientes com AIDS, com e sem leucoencefalopatia multifocal progressiva, em São Paulo, Brasil

Processo: 08/03918-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de junho de 2008
Vigência (Término): 30 de novembro de 2008
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
Pesquisador responsável:Claudio Sergio Pannuti
Beneficiário:Marcelo Plaisant Geraldi
Instituição-sede: Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMT). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:07/04681-1 - Caracterização molecular do poliomavírus humano JC em pacientes com AIDS, com e sem leucoencefalopatia multifocal progressiva, em São Paulo, Brasil, AP.R
Assunto(s):Etiologia   AIDS   Técnicas de genotipagem   Vírus JC   Reação em cadeia por polimerase (PCR)

Resumo

Plano de Atividades para um bolsista de de nível 3 para o projeto FAPESP 2007/04681-1Título:Treinamento técnico em técnicas moleculares básicas, no âmbito do projeto FAPESP 2007/04681-1, intitulado "CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO POLIOMAVÍRUS HUMANO JC EM PACIENTES COM AIDS, COM E SEM LEUCOENCEFALOPATIA MULTIFOCAL PROGRESSIVA, EM SÃO PAULO, BRASIL"ResumoO vírus JC (VJC) é o agente etiológico da leucoencefalopatia multifocal progressiva (LEMP), uma doença caracterizada por lesões focais não expansivas do sistema nervoso central que atinge pacientes imunocomprometidos. O objetivo principal do presente estudo é identificar os diferentes genótipos em amostras de líquor e em linfócitos de sangue periférico de pacientes com aids e LEMP e compará-los àqueles presentes em linfócitos de pacientes com aids, sem LEMP, para verificar se existe alguma maior proporção de um genótipo em particular do vírus nos casos com LEMP em relação aos genótipos obtidos de pacientes com aids sem LEMP, pareados com os casos para a contagem de células CD4+ . Adicionalmente, serão identificadas as seqüências da região regulatória das amostras do VJC obtidas nos dois grupos de pacientes. Os objetivos secundários consistem em padronizar a técnica de PCR em tempo real, comparara a sensibilidade e especificidade do PCR em tempo real com a PCR convencional na detecção do vírus JC e determinar a carga viral liquorica do vírus JC através da PCR em tempo real.Casuística: Está prevista a inclusão de amostras de líquor e sangue de 40 casos de pacientes com aids e diagnóstico de LEMP, atendidos em 3 centros hospitalares: Instituto de Infectologia Emílio Ribas, Hospital das Clínicas da FMUSP e UNICAMP. Amostras de sangue de pacientes com aids sem LEMP, pareados com os pacientes com LEMP quanto ao número de células CD4+ também serão colhidas, após assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido, para avaliar eventuais diferenças na prevalência dos diferentes genótipos do VJC entre os dois grupos. A pesquisa do vírus JC será realizada através de duas diferentes técnicas de PCR (PCR convencional e PCR em tempo real). Nas amostras que se apresentarem positivas para o vírus será determinada a carga viral liquórica e sangüínea por PCR em tempo real e uma nova reação de PCR será realizada, desta vez com primers complementares ao gene viral que codifica a proteína VP1 do capsídeo, para realização da genotipagem, através do seqüenciamento dessa região. A análise da região regulatória das amostras do VJC obtidas nos dois grupos de pacientes também serão feitas por sequenciamento.Plano de trabalho do bolsista:1. Extração de ácidos nucléicos de amostras clínicas (líquido céfaloraquidiano e sangue)2. Amplificação das sequencias alvo, utilizando iniciadores específicos para a região precoce do genoma dos poliomavírus, comum aos vírus JC e BK, através da técnica de reação em cadeia por polimerase.3. Detecção de DNA de poliomavírus nas amostras através de eletroforese em gel de agarose.4. Diferenciação entre virus JC e vírus BK nas amostras positivas através de digestão do produto amplificado com enzima de restrição Bam H1, que consegue clivar o fragmento do vírus JC em dois outros menores com 120 e 53 pares de bases.5. Nas amostras positivas para vírus JC, será realizada nova PCR, desta vez com iniciadores complementares ao gene que codifica a proteína VP1 do capsídio viral, para realização da genotipagem através de sequenciamento dessa região. 6. Processamento das amostras por PCR em tempo real, depois que esta técnica for padronizada pela equipe do projeto.7. Participação na organização dos dados, análise e discussão dos resultadosObs. Embora o estudo envolva sequenciamento das amostras positivas, o bolsista não participará desta fase,

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