Avaliação do perfil de expressão gênica em grande escala de células-tronco da polpa e de odontoblastos utilizando cDNA microarrays

• Processo: 08/10058-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2008
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2009
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular
• Pesquisador responsável: Karina Fittipaldi Bombonato Prado
• Beneficiário: Maidy Rehder Wimmers Ferreira
• Instituição Sede: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 08/53937-1 - Avaliacao do perfil de expressao genica em grande escala de celulas-tronco da polpa e de odontoblastos utilizando cdna microarrays., AP.R
• Assunto(s): Células-tronco Odontoblastos Expressão gênica Polpa dentária
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: cDNA microarrays | Células-tronco | expressão gênica | Odontoblastos | Polpa | Cultura de Células

Resumo

O extraordinário potencial regenerativo do complexo dentino-pulpar enfatiza a importância da caracterização dos processos celulares e moleculares envolvidos na regeneração dentinária. Atualmente acredita-se que células-tronco da polpa são as responsáveis por esta regeneração, tornando a terapia com células-tronco uma promessa na reconstrução e substituição de elementos dentários ausentes devido a uma série de patologias. A investigação da expressão gênica de células indiferenciadas e de células com o fenótipo odontoblástico pode determinar papéis funcionais fundamentais de genes relevantes e aplicáveis neste tipo de terapia. Este estudo pode ser feito através do cDNA microarray, um método que pode quantificar milhares de sequências gênicas em um único experimento. O presente projeto visa a utilização desta técnica para apontar genes associados com a diferenciação odontoblástica. DESCRIÇÃO DOS OBJETIVOS: será realizada uma análise comparativa de expressão gênica em larga escala (transcriptoma) de células-tronco da polpa dentária e de células diferenciadas em odontoblastos (linhagens originárias de camundongos). Pretendemos apontar genes candidatos ao controle da diferenciação de células-tronco em odontoblastos. Além do cDNA microarray, serão efetuados experimentos para comprovação do fenótipo odontoblástico (avaliação adesão, proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total, atividade de fosfatase alcalina, formação de nódulos de mineralização e detecção de proteínas essenciais para a função dos odontoblastos através de microscopia de imunofluorescência indireta). PLANO DE TRABALHO: Metodologia: Células-tronco da polpa dentária de camundongos (OD-21) de linhagem odontoblástica de camundongos (MDPC-23) serão cultivadas em garrafas de cultura de 75 cm3 com 10 ml de meio de cultura D-MEM, 10% de soro fetal bovino e 2,75ml de penicilina-streptomicina. Nas células MDPC-23, serão adicionados 50 mg de ácido ascórbico para promover a formação de colágeno e matriz extracelular (Franceschi e cols., 1994) e 2mM de beta-glicerofosfato para obtermos a formação e mineralização de nódulos em multicamada (Tenenbaum, 1981). Durante todo o tempo de cultivo as células serão mantidas a 37oC em atmosfera umidificada, contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico e os meios serão trocados a cada dois dias. Após a confluência, as células serão removidas dos frascos de cultura por meio de EDTA 1mM (Gibco) e tripsina 0,25% (Gibco) e contadas utilizando um hemocitômetro (Fisher Scientific). Após o plaqueamento das células em placas de 24 poços a uma densidade de 10.000 células/poço (N=5), avaliaremos o fenótipo odontoblástico através de adesão (24 horas de cultura), proliferação e viabilidade celular, quantificação de proteínas totais e atividade de fosfatase alcalina (3, 7 , 10 e 14 dias de cultura), detecção e quantificação de matriz mineralizada (14 dias de cultura), imunolocalização das proteínas sialofosfoproteína dentinária (DSPP), fosfatase alcalina (ALP) e osteopontina (OPN) (24 horas e 3 dias de cultura). Para realizar os experimentos de cDNA microarray, as células serão colocadas em garrafas de cultura de 75 cm3 e após a confluência, serão submetidas à extração de RNA com kits específicos e as amostras serão processadas para obtenção do perfil de expressão gênica das duas linhagens celulares. Todos os experimentos serão realizados em triplicata. (AU)