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Derivação de células tronco embrionárias, com a utilização de inibidores MEK1 e GSK3, a partir de embriões de camundongo ativados partenogeneticamente

Processo: 11/18170-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2011
Vigência (Término): 31 de julho de 2012
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Pesquisador responsável:Marcelo Fábio Gouveia Nogueira
Beneficiário:Bruna Castilho Soto Campanha
Instituição-sede: Faculdade de Ciências e Letras (FCL-ASSIS). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Assis. Assis , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:06/06491-2 - Quimerismo embrionário nas espécies murina e bovina: interação da massa celular interna, de embriões produzidos in vivo, com embriões receptores produzidos in vitro, AP.JP
Assunto(s):Partenogênese   Células-tronco embrionárias   Epigênese genética   Imprinting genômico

Resumo

A complementação genômica parental é requerida para o desenvolvimento fetal a termo, em mamíferos. Devido à origem exclusivamente materna dos embriões partenogenéticos, importantes genes imprinted paternos não são expressos e, consequentemente, todo o desenvolvimento do concepto é comprometido. A obtenção de uma linhagem de células tronco embrionárias (CTE), realizada a partir da massa celular interna de embriões em estágios pré-implantacionais, tem como vantagem o conhecimento genotípico dessa linhagem para as características, de produção ou reprodução, do animal que vier a ser produzido a partir destas. As CTE partenogenéticas (CTEPG) vêm sendo utilizadas como ferramenta, na biotecnologia animal e na embriologia básica, em experimentos relacionados com o entendimento de eventos e mecanismos da biologia do desenvolvimento e fundamentos do conceito de "nicho" celular. Recentemente, o uso de inibidores de vias celulares para a diferenciação e que mantém o estado pluripotente - e indiferenciado - das colônias de CTE é uma alternativa utilizada em linhagens de animais (camundongos) ditas menos permissivas ou ainda para aumentar a eficácia da derivação das CTE. Os fármacos responsáveis por inibir as vias GSK3 e MEK1 são os mais utilizados, e preferencialmente em conjunto, mais comumente denominados de "2i" (de "dois inibidores" em inglês). Oócitos obtidos de camundongos transgênicos (linhagem C57BL/6/EGFP) serão submetidos ao protocolo de ativação partenogenética e cultivados até o estágio de blastocisto. Os blastocistos terão suas zonas pelúcidas removidas e serão cultivados diretamente em placas de 96 poços contendo meio para derivação de células tronco, com os inibidores, sobre uma monocamada de fibroblastos inativados mitoticamente. Após 5 a 6 dias, as prováveis colônias aderidas à monocamada serão avaliadas quanto à morfologia, repassadas para outra placa (somente aquelas com características de tronco embrionárias e mediante a dissecção mecânica da colônia com exclusão das células periféricas morfologicamente semelhantes ao trofectoderma) e cultivadas até o 9o dia para uma nova passagem. Após a terceira passagem (14o dia de cultura), as linhagens que estiverem com o crescimento compatível serão avaliadas mediante marcadores morfológicos (razão entre núcleo:citoplasma e formato celular), celular (cariotipagem) e funcionais. Este projeto de pesquisa tem por objetivo obter linhagens de células tronco embrionárias a partir de embriões fertilizados in vivo (controle do imprinting) e ativados partenogeneticamente (ausência de expressão de alelos paternos dos genes imprinted), visando a caracterização dos efeitos epigenéticos decorrentes da própria derivação das CTE. Será avaliada a expressão de genes imprinted (Igf2, Igf2r e H19), de pluripotência (Oct4 e Sox2) e específicos de linhagens celulares (Cdx2 e Oct4) nos embriões (blastocistos) e nas linhagens de células tronco derivadas dos embriões controle (fertilização in vivo) e partenogenéticos.