Bothrops protease A (BPA): uma nova ferramenta para o planejamento de agentes terapêuticos em trombose e hemostasia.

• Processo: 11/05055-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2012
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2013
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Solange Maria de Toledo Serrano
• Beneficiário: Edson Takeshi Yamashiro
• Instituição Sede: Instituto Butantan. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 98/14307-9 - Center for Applied Toxinology, AP.CEPID
• Assunto(s): Glicosilação Proteômica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Expressão recombinante | Fibrinogenólise | glicosilação | proteômica | Serinoproteinase | Proteômica

Resumo

A Bothrops protease A (BPA) é uma serinoproteinase isolada do veneno da Bothrops jararaca, que apresenta especificidade enzimática semelhante a da tripsina. Diferentemente de muitas serinoproteinases de venenos, ela é estável entre os pHs 3 e 9, e resiste ao aquecimento a 90°C por 10 min. A BPA é altamente glicosilada e migra em gel de SDS-poliacrilamida como uma banda única de 67 kDa. Entretanto, o cDNA que a codifica mostra que a BPA é composta de 234 resíduos de aminoácidos com massa molecular de 25.409 Da, o que indica que cerca de 60% de sua massa molecular verificada por eletroforese corresponde a carboidratos. Sua seqüência de aminoácidos mostra oito sítios putativos de N-glicosilação e dois sítios de O-glicosilação. A N-deglicosilação e a O-deglicosilação enzimática completa só é possível sob condições desnaturantes e os produtos principais gerados são de 25 kDa e 55 kDa, respectivamente, os quais são enzimaticamente inativos. Recentemente mostramos que a BPA apresenta uma potente atividade proteolítica sobre o fibrinogênio e a fibrina in vitro. As cadeias alfa e beta do fibrinogênio são rapidamente degradadas pela BPA enquanto que, no caso da fibrina, somente a cadeia alfa é hidrolisada. A deglicosilação parcial da BPA não afeta sua atividade proteolítica sobre essas proteínas. In vivo a BPA preveniu em ratos a formação de trombo causado por estase da veia cava ou pela injúria da veia jugular. Dessa forma a BPA se mostra como uma proteína com potencial aplicação terapêutica por ser uma enzima bastante estável e com alta atividade fibrinogenolítica. Nesse trabalho pretendemos obter a BPA recombinante em Pichia pastoris e realizar mutações sítio-dirigidas para avaliar o papel da porção de carboidratos na atividade proteolítica da BPA sobre o fibrinogênio in vivo.