Expressão recombinante, e caracterização funcional dos domínios não catalíticos de uma metaloproteinase da classe P-III do veneno da serpente Bothrops jararaca, utilizando um sistema de expressão livre de célula

• Processo: 17/09648-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2017
• Data de Término da vigência: 15 de março de 2020
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Milene Cristina Menezes dos Santos
• Beneficiário: Jessica de Alcantara Ferreira
• Instituição Sede: Instituto Butantan. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/07467-1 - CeTICS - Centro de Toxinas, Imuno-Resposta e Sinalização Celular, AP.CEPID
• Assunto(s): Proteômica Metaloproteinases Venenos de serpentes Bothrops jararaca Proteínas recombinantes
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cloangem | Expressão de proteína recombinante em sistema livre de célula | Metaloproteinase de venenos de serpentes | Proteômica

Resumo

Proteinases estão entre os componentes majoritários do proteoma dos venenos de serpentes viperídeas. Neste contexto, as metaloproteinases de veneno de serpentes (SVMPs em inglês) estão entre os componentes abundantes e são responsáveis por diversos efeitos patológicos no envenenamento. As SVMPs contêm domínios regulatórios adicionais ao domínio catalítico, envolvidos em seus mecanismos de interação com a matriz extracelular e com integrinas. O fator hemorrágico 3 (HF3), é uma metaloproteinase altamente hemorrágica, isolada do veneno da serpente Bothrops jararaca, composta pelos domínios catalítico, tipo-disintegrina (D) e rico em cisteínas (C), e apresenta 5 sítios putativos de N-glicosilação (3 sítios no domínio catalítico e 2 no domínio rico em cisteínas). Trabalhos anteriores sobre o papel desses domínios na atividade biológica do HF3 revelaram que proteínas recombinantes contendo o domínio rico em cisteínas, obtidas em E. coli e em fusão com a GST (Gluthationa S-transferase) (GST-DC e GST-C), foram capazes de inibir a agregação plaquetária induzida pelo colágeno e de induzir resposta pró-inflamatória em camundongos, e essas atividades foram inibidas por anticorpos integrinas (anti-±M e anti-²2), sugerindo um papel para o domínio rico em cisteínas em promover efeitos pró-inflamatórios do HF3 mediados pela integrina ±M/²2. A análise da interação do HF3 com proteínas da matriz extracelular e do plasma humano revelou que o HF3 interage os colágenos dos tipos I e VI, fibrinogênio, fibronectina e laminina, proteínas estas que são importantes para a manutenção da integridade dos vasos capilares e da hemostasia. Neste projeto pretendemos obter a proteína recombinante DC/HF3 na forma selvagem, e contendo mutações sítio-dirigidas na região hiper variável do domínio rico em cisteínas (resíduos básicos K568A, K569A e K575A; e resíduos ácidos D573A, E579A, D580A, e D582A) utilizando um sistema de expressão livre de célula derivado de E. coli, a fim de identificar resíduos de aminoácidos importantes para sua interação com substratos do HF3, utilizando ensaios de ligação em fase sólida e avaliando a capacidade da proteína DC selvagem e mutante em inibir a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. Os resultados deste estudo deverão avançar o conhecimento sobre a interação de metaloproteinases com seus alvos moleculares. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

FERREIRA, JESSICA DE ALCANTARA; SILVA, DILZA TREVISAN; DE TOLEDO SERRANO, SOLANGE MARIA; MENEZES, MILENE CRISTINA. EXPRESSION OF MUTANT FORMS OF THE NON-CATALYTIC DOMAINS OF A METALLOPROTEINASE OF THE VENOM OF THE SNAKE BOTHROPS JARARACA USING A CELL-FREE EXPRESSION SYSTEM. Toxicon, v. 168, p. 2-pg., 2019-10-05. (13/07467-1, 17/09648-4)