Produção de proteinases recombinantes do veneno de Bothrops jararaca usando sistemas de expressão livre-de-célula derivados de extratos de células eucarióticas

• Processo: 17/16643-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Vigência (Início): 09 de outubro de 2017
• Vigência (Término): 08 de janeiro de 2018
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Solange Maria de Toledo Serrano
• Beneficiário: Milene Cristina Menezes dos Santos
• Supervisor: Thierry Vernet
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Local de pesquisa: Institut de Biologie Structurale (IBS), França
• Vinculado à bolsa: 15/23691-4 - Ativ pró-inflamatória de proteinases de venenos de serpentes: i) obtenção de proteinases recombinantes em sistema livre de CEL; ii) geração de microvesículas por monócitos estimulados com proteinases nativas e recomb e sua interação com células endoteliais, BP.PD
• Assunto(s): Proteômica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Expressão de proteínas recombinantes em sistema livre de células | Extrato de células de eucarióticas | Metaloproteinases de venenos de serpente | Serinoproteinases de venenos de serpente | Proteômica

Resumo

As proteinases de veneno de serpente estão associadas à patogênese relacionada ao envenenamento, incluindo hemorragia, inflamação, necrose e desequilíbrio na hemostasia. As metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são sintetizadas como precursores multi-domínios latentes, cujo processamento gera enzimas cataliticamente ativas ou domínios livres não enzimáticos. Serinoproteinases de venenos de serpentes (SVSPs) são sintetizadas como precursores contendo um pró-peptídeo. A expressão recombinante dos precursores das SVMPs e SVSPs tem apresentado dificuldades devido à instabilidade da estrutura polipeptídica. Por outro lado, os domínios não catalíticos das SVMPs foram obtidos na forma recombinante utilizando sistemas de expressão procariótica. Recentemente, mostramos pela primeira vez a expressão do precursor de HF3, uma SVMP altamente hemorrágica presente no veneno de Bothrops jararaca e de seus domínios não catalíticos, utilizando um sistema de expressão livre de células derivado de E. coli. O precursor de HF3, composto pelos domínios pró-, metaloproteinase, tipo-disintegrina e rico em cisteínas, contendo 38 resíduos de cisteínas, foi obtido e purificado. Uma proteína composta pelos domínios tipo-disintegrina e rico em cisteínas (proteína DC), e outra composta pelo domínio rico em cisteínas (proteína C) foram expressos in vitro individualmente e purificadas. Ambas as proteínas se mostraram funcionalmente ativas em ensaios de interação com proteínas da matriz extracelular e na modulação da clivagem do fibrinogênio pelo HF3. Esses dados indicaram que a técnica de expressão de proteínas recombinantes em sistema livre de células derivadas de E. coli, é uma alternativa atraente para o estudo da estrutura e função de proteínas multi-domínios com um alto número de resíduos de cisteína. No entanto, a maioria das proteinases de veneno são proteínas glicosiladas e suas cadeias de carboidratos desempenham um papel importante na sua estabilidade e atividades funcionais, enquanto que as proteínas recombinantes obtidas usando o sistema de expressão livre de células derivadas de E. coli não são glicosiladas. Para superar este problema e compreender melhor a relação entre estrutura e função das proteinases presentes no veneno de B. jararaca, o objetivo deste estudo é obter as seguintes proteínas na forma recombinante utilizando sistemas de expressão livre de célula derivados de extratos de células eucarióticas: (I) A metaloproteinase HF3 e a serinoproteinase PA-BJ serão expressas usando o sistema 1-Step CHO High-Yield IVT, que se baseia na tradução in vitro utilizando lisados de células CHO, a fim de obter quantidades suficientes das proteínas na forma glicosilada, para análise estrutural; (II) Em paralelo, serão obtidos lisados derivados de células CHO e adaptados para as condições de reação in vitro para a expressão do HF3 e da PA-BJ, com o objetivo de aumentar o rendimento e modular o processo de glicosilação das proteínas.