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Entendo as diferenças cinéticas entre as isoformas Kidney-Type Glutaminase e Glutaminase C

Processo: 11/15107-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de março de 2012
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2013
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Andre Luis Berteli Ambrosio
Beneficiário:Amanda Petrina Scotá Ferreira
Instituição-sede: Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações (Brasil). Campinas , SP, Brasil
Assunto(s):Cinética enzimática   Biofísica   Neoplasias   Glutaminase

Resumo

O metabolismo da glutamina é chave para a manutenção do fenótipo altamente proliferativo característico das células tumorais, via catálise desse aminoácido para geração de precursores biossintéticos (envolvidos na síntese de lipídeos, aminoácidos e nucleotídeos) assim como fonte de oxidação de carbono e geração de energia. O primeiro passo desse processo metabólico, ou seja, a conversão de glutamina em glutamato e amônia é realizado pelas glutaminases. Três isoenzimas das glutaminases já foram identificadas em mamíferos: Kidney-type glutaminase (KGA), sua isoforma por splicing alternativo Glutaminase C (GAC), e a Liver-Type Glutaminase (LGA), codificada por um gene distinto. Cristalização e estudos de SAXS da isoforma GAC realizados em nosso laboratório revelaram que tetrâmeros são formados pelo domínio catalítico e que a tetramerização estabiliza um "gating loop" em conformação aberta, passo essencial para a acessibilidade do substrato glutamina. Além, o íon fosfato aumenta a taxa de turn-over da enzima e a libera da inibição pelo produto glutamato. Entretanto, curiosamente temos observado que, apesar das isoformas KGA e GAC serem idênticas em seu domínio catalítico, ambas apresentam distintas eficiências catalíticas para o substrato glutamina. Procurando entender a natureza desta diferença, o objetivo deste projeto é determinar a constante de dissociação tetrâmero-dímero destas isoformas, assim como a importância do segmento C-terminal da GAC para atividade e oligomerização. Mais, iremos realizar mutações sítio dirigidas de resíduos do "gating loop" visando decifrar seu exato mecanismo de ação no processo de tetramerização-ativação destas isoformas. Por fim, procuraremos uma melhor descrição do movimento deste loop entre as formas diméricas e tetraméricas através da cristalização de um mutante incapaz de tetramerizar, assim como através do uso da técnica de ressonância de spin eletrônico de sondas adicionadas nesta região.