Entendendo o mecanismo de ativação e as diferenças cinéticas entre as isoformas Kidney-type Glutaminase e Glutaminase C

Autor(es)

Amanda Petrina Scotá Ferreira

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2013-12-13

Membros da banca

Andre Luís Berteli Ambrosio; Artur Torres Cordeiro; Leandro Martínez

• Orientador: Andre Luís Berteli Ambrosio

Resumo

A produção de energia em células cancerosas é anormalmente dependente da glicólise aeróbica, resultando em aumento do consumo de glutamina para suprir os processos anabólicos. A hidrólise da glutamina é feita pelas glutaminases, as quais possuem três isoformas identificadas em mamíferos: Kidney-type glutaminase (KGA), Glutaminase C (GAC), e a Liver-type Glutaminase (LGA). Apesar das isoformas KGA e GAC serem idênticas em seu domínio catalítico, ambas apresentam distintas eficiências catalíticas para glutamina. Este projeto tem como objetivo encontrar a razão para esta diferença catalítica, estudando estruturalmente estas isoformas. A estrutura cristalográfica da GAC continha uma unidade assimétrica tetramérica, e como passo essencial para a acessibilidade do substrato glutamina essa tetramerização possivelmente estabiliza um "gating loop" em conformação aberta. Mutações sítio-dirigidas de resíduos do "gating loop" (L321RFNKL326) perturbaram a atividade da enzima, o que se correlacionou diretamente com a capacidade de oligomerização: mutantes que perderam atividade não foram capazes de formar oligômeros maiores que tetrâmero. Por imagens de microscopia eletrônica de transmissão, utilizando negative staining, vimos que a GAC forma estruturas filamentosas na presença de fosfato. Curiosamente, um mutante da região do gating loop, denominado GAC.K325A, apresentou uma eficiência catalítica alta e foi capaz de formar oligômeros extensos. Além disso, o mutante é insensível a fosfato e ao BPTES. O mutante GAC.R322A perdeu a atividade e não foi capaz de formar polímeros nem mesmo na presença de ativador fosfato. Portanto, a capacidade de oligomerizar das glutaminase justifica a atividade apresentada pela proteína: a GAC ¿ a glutaminase de maior atividade ¿ formou os maiores polímeros lineares, seguida pela KGA e, respectivamente, pela LGA (de baixa eficiência enzimática e insensível ao fosfato inorgânico). Além disso, mostramos que o mecanismo de inibição do BPTES é explicado pelo rompimento dos oligômeros. Apresentamos um mecanismo para a formação destes oligômeros, através da combinação de deleções, mutações pontuais, microscopia eletrônica, dinâmica e docking molecular. Nós simulamos a acetilação da Lis311 e sugerimos que esta modificação pós-traducional pode controlar níveis enzimáticos ao regular negativamente a formação de fibra. Por marcação com fluoróforo, determinamos constantes de dissociação aparentes para as espécies oligoméricas das isoformas GAC e KGA. Como a marcação interferiu na atividade enzimática, acreditamos que a técnica criou artefatos impróprios para percepção de interação diferencial entre superestruturas dessas isoformas. Células MDA-MB 231 com expressão endógena e knocked down de GAC foram utilizadas em ensaios celulares. Transfecções com GAC.K325A-V5 proliferaram mais, consumiram mais glutamina do meio de cultura e apresentaram maior turnover na medição de atividade de glutaminase. Coletivamente, estes indícios de que a formação de superestrutura de glutaminases in vivo propicia vantagens adaptativas às células tumorais mostram a importância da enzima como alvo terapêutico (AU)

• Processo FAPESP: 11/15107-0 - Entendo as diferenças cinéticas entre as isoformas Kidney-type Glutaminase e glutaminase C
• Beneficiário: Amanda Petrina Scotá Ferreira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado