Expressão, purificação e caracterização estrutural das proteínas capsidiais codificadas pelo Grapevine vírus a e Grapevine vírus b

• Processo: 11/23524-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
• Data de Início da vigência: 02 de abril de 2012
• Data de Término da vigência: 01 de julho de 2012
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Raghuvir Krishnaswamy Arni
• Beneficiário: Vinícius dos Santos Santana
• Supervisor: Christian Betzel
• Instituição Sede: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de São José do Rio Preto. São José do Rio Preto , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Universität Hamburg (UHH), Alemanha
• Vinculado à bolsa: 10/00896-6 - Expressão, purificação e caracterização estrutural das proteínas capsidiais codificadas pelo Grapevine vírus a e Grapevine vírus b, BP.DR
• Assunto(s): Cristalografia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Caracterização estrutural | Cristalografia | expressão | Grapevine Virus A e B | Proteína Capsidial | purificação | Biologia Estrutural

Resumo

O Grapevine virus A e B (GVA e GVB) são vírus de RNA de fita simples, responsáveis por doenças na videira com grande impacto econômico para a viticultura. Este projeto pretende entender a nível atômico as proteínas consideradas responsáveis pelo movimento do vírus célula a célula, o mecanismo de reconhecimento por componentes celulares do vetor e de seu hospedeiro, e o mecanismo de formação do capsídeo ("self-assembly"). Dessa forma, os dados estruturais serão importantes para o entendimento das interações específicas que poderão servir futuramente como alvo para a desmontagem do capsídeo e transmissão do vírus. Expressamos a proteína capsidial do Grapevine virus B que foi encontrada exclusivamente em corpos de inclusão. Foram testados exaustivamente vários protocolos para obter a proteína na forma nativa. Utilizando o protocolo descrito por Studier (2005), foi obtida a amostra na forma solúvel e enovelada. Experimentos de Dicroísmo Circular foram realizados para verificar o grau de enovelamento e conteúdo de estrutura secundária da proteína. Os dados da deconvolução indicaram 71% de ±-hélice, 5% de ²-folha e 24% de outras estruturas. Ainda encontramos problemas durante a concentração da proteína que mostrou uma forte tendência à precipitação após 24 horas, e o screening de tampões resultou em um melhoramento significativo na estabilidade e solubilidade (concentração superior a 7 mg/mL). Espalhamento Dinâmico de Luz indicou um alto grau de agregação-possível formação do capsídeo (raio hidrodinâmico de 100 nm). Com essa colaboração, pretendemos obter essa amostra na forma nativa, monomérica, e monodispersa, para permitir sua caracterização estrutural completa, utilizando as técnicas de espalhamento dinâmico de luz, ressonância nuclear magnética, espalhamento de raios-x a baixos ângulos e cristalografia. Além disso, iremos aprender novas técnicas que pretendemos implantar em nosso laboratório futuramente. (AU)