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Clonagem do gene da CPM humana e expressão em células HUVEC

Processo: 14/21093-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de novembro de 2014
Vigência (Término): 30 de junho de 2015
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:João Bosco Pesquero
Beneficiário:Carolina Caldas Hoff
Instituição-sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Clonagem   Genes   Expressão gênica   Sistema calicreína-cinina   Atividade enzimática   CPM

Resumo

O sistema calícreína-cininas realiza ações na inflamação e controle da pressão sanguínea através de proteínas sanguíneas, de forma parácrina ou autócrina. Uma vez que ocorre lesão tecidual, a pré-calicreína, com o auxílio do fator de Hageman ativo, transforma-se em proteases que recebem o nome de alicreínas. Através da interação dessas calicreínas com o cininogênio, que é uma ±-globulina plasmática, são liberados peptídeos chamados cininas. Esses peptídeos são substratos das carboxipeptidases, como a carboxipeptidase M (CPM), convertendo-os em des-Arg-cininas, as quais são agonistas dos receptores B1 de cininas, que também são ativados quando ocorre lesão nos tecidos. Sabe-se que CPM e receptores B1 de cininas estão co-localizados em microdomínios da membrana plasmática, interagindo entre si, de maneira que a enzima facilita a sinalização desses receptores, aumentando a liberação de NO. Sendo assim, é plausível a ideia de que a função peptídica esteja relacionada com a localização de peptidases, tais como a CPM. Entretanto, não há dados até o momento na literatura demonstrando o resultado desta interação sob o aspecto da enzima. O objetivo central deste trabalho é clonar o gene da CPM humana e a transfectar em células HUVEC, criando um modelo celular artificial para estudo, que será fundamental para testar a hipótese que a interação entre CPM e receptores B1 de cininas pode afetar a atividade da enzima. Este trabalho irá contribuir para o entendimento geral do sistema calicreína-cininas e local, na interação entre essas proteínas. Espera-se ter a CPM clonada no vetor de expressão pcDNA3.1TM/Hygro/LacZ, cuja análise de atividade enzimática em células HUVEC-CPM mostre-se aumentada significamente. Nossa hipótese é que a atividade enzimática da CPM clonada no vetor de expressão pcDNA3.1TM/Hygro/LacZ e expressa em células HUVEC-B1 esteja significamente aumentada em relação às células expressando apenas a enzima. Portanto, esta será a primeira etapa na construção das ferramentas moleculares essenciais para compreendermos e avaliarmos o impacto da interação CPM-receptor B1 na atividade da enzima.