Otimização de ferramentas de biotecnologia para crescimento e transformação de células patogênicas de Leptospira interrogans

• Processo: 17/24549-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2018
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2019
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Bioquímica de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Cristiane Rodrigues Guzzo Carvalho
• Beneficiário: Camila Carneiro Lambertucci
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Proteínas de fluorescência verde Biotecnologia Manipulação genética Genoma bacteriano Bactérias patogênicas Plasmídeos Virulência Vacinas Zoonoses Leptospirose Leptospira interrogans CRISPR-Cas9
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Gfp | Knockin | knockout | plasmideo suicida | transformação | Bioquímica e Biologia Estrutural

Resumo

O objetivo deste projeto é a padronização de um protocolo para crescimento de L. interrogans em meio semissólido e transformação das células. A tentativa de obter um knockout gênico será realizada de duas formas que em geral causam knockout gênico apolar: uso de plasmídeos suicidas (plasmídeos que não replicam e tem que ser integrado no genoma da bactéria), já amplamente conhecida e utilizada em outras espécies de bactérias e pelo sistema CRISPR-Cas9, em alta, porém ainda em estudo e desenvolvimento, sem apresentar por hora resultados de knockout em L. interrogans por esse método. O desafio reside, primeiramente, na dificuldade em crescer Leptospira em meio semissólido, visto que são bactérias microaerofilas e demoram cerca de 4 a 6 semanas para crescer. Obtendo um protocolo padronizado de crescimento com bons resultados, tentaremos realizar a modificação genética por inserção de green fluorescente protein (GFP) no genoma bacteriano da L. interrogans, com a finalidade de obter visualmente o resultado esperado. Este processo é conhecido como knockin. De outra forma, as células knockout e tipo selvagem serão analisadas por PCR via amplificação do gene de interesse. O projeto é de grande importância pois ampliará os conhecimentos da biologia básica de uma bactéria há 100 anos descoberta, mas com pouco conhecimento de seus mecanismos de patogenicidade. Com este conhecimento que será proporcionado ao desenrolar do projeto, o knockout de determinados genes pode levar a criação de uma bactéria não virulenta e assim a possível criação de vacinas contra a zoonose mais espalhada pelo mundo e igualmente negligenciada, a Leptospirose. (AU)