Análise transcricional de genes marcadores osteogênicos e adipogênicos em células do ligamento periodontal humano com alto e baixo potencial osteogênico

• Processo: 20/05102-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2020
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2021
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Odontologia - Periodontia
• Pesquisador responsável: Denise Carleto Andia
• Beneficiário: Ana Carolina Bontempi
• Instituição Sede: Vice-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação. Universidade Paulista (UNIP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Cultura de células Adipogenia Cromatina Células-tronco mesenquimais Regulação da expressão gênica Processos biológicos Reação em cadeia da polimerase em tempo real Citometria de fluxo Técnicas in vitro Estudo comparativo
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Regulação gênica | Cultura de células mesenquimais

Resumo

As células mesenquimais do ligamento periodontal de humanos (PDLCs) demonstram potencial de diferenciação em algumas linhagens e são candidatas a terapias regenerativas. Recentemente, nosso grupo de pesquisa caracterizou PDLCs com diferentes potenciais osteogênicos, ou seja, com alta (h-PDLCs) ou baixa (l-PDLCs) capacidade de formação de nódulos minerais in vitro. Essas PDLCs foram submetidas ao Assay for Transposase Accessible Chromatin, seguido de sequenciamento de próxima geração (ATAC-Seq) e análises de Bioinformática (FAPESP/University of Birmingham - 2017/07944-5), com o objetivo de identificar regiões acessíveis da cromatina e, portanto, potencialmente ativas e regulatórias. Interessantemente, mesmo no nível basal (sem nenhum estímulo à diferenciação) essas PDLCs já demonstram diferenças em vários quesitos analisados, com destaque para as análises dos superenhancers e suas vias de sinalização e processos biológicos. As análises iniciais apontam para a adipogênese como sendo a via ativa nas l-PDLCs, enquanto nas h-PDLCs, as vias ativadas são as osteogênicas. Estes resultados serviram como base para o desenvolvimento deste projeto de IC, que tem como objetivo confirmar os achados do ATAC-Seq a nível transcricional, ou seja, confirmar se as regiões regulatórias encontradas estão funcionalmente ativas e se traduzem em transcritos gênicos, confirmando, não só o perfil regulatório distinto entre as PDLCs, mas também o perfil transcricional distinto. As PDLCs serão obtidas de terceiros molares de pacientes entre 18 e 20 anos e caracterizadas quanto à sua indiferenciação (presença/ausência de marcadores CD105, CD166, CD34 e CD45, por citometria de fluxo), potencial osteogênico (Vermelho de Alizarina - 21 dias de indução à osteogênese) e adipogênico (Oil Red O - 25 dias de indução à adipogênese) distintos. As células serão coletadas após 10 dias em cultura e o RNA será extraído pelo método do TRIzol. Os níveis dos transcritos de marcadores adipogênicos (PPAR-gama, CEBPD/B/A e KLF15) e osteogênicos (CTNNB1, WNT10a e Colágeno tipo 1), apontados pelo ATAC-Seq, serão avaliados por PCR em tempo real, utilizando-se como gene referência o mais estável (GAPDH, B-ACTIN ou 16S). Os cálculos dos resultados serão realizados pelo método comparativo do ””CT.