Determinação estrutural, por cryo-EM, de uma hemocianina de molusco com impacto biomédico substancial

• Processo: 21/03998-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Andre Luis Berteli Ambrosio
• Beneficiário: Matías Nahuel Ellena
• Instituição Sede: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Biologia estrutural Hemocianina Microscopia Microscópios
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cryo-EM | Hemocianinas | Biologia Estrutural

Resumo

Esta proposta para bolsa de mestrado busca viabilizar as atividades de pesquisa previstas no Auxílio Regular FAPESP-CONICYT 2019/19918-5. No contexto do notável progresso em biologia estrutural, possibilitado pela crio-microscopia eletrônica de partículas isoladas (cryo-EM), deu-se origem à chamada "revolução da resolução", principalmente devido à sua capacidade de fornecer informações estruturais de alta resolução de complexos proteicos grandes e dinâmicos. O microscópio Titan Krios, em operação no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano), estabeleceu o Brasil como o líder em cryo-EM na América Latina. No entanto, para otimizar o uso e a ocupação de tais instalações pela comunidade de biologia estrutural, torna-se urgente capacitar pesquisadores nos laboratórios da região. O amplo acesso a essa metodologia, por meio de esforços colaborativos entre grupos de pesquisa do Chile e do Brasil, representa uma oportunidade inestimável para promover ainda mais o desenvolvimento científico regional, empregando uma metodologia de ponta. Neste projeto, propomos uma abordagem sinergética para determinar a estrutura cryo-EM da hemocianina de Concholepas concholepas (CCH), um organismo marinho prevalente nas costas do Pacífico sul. Hemocianinas são oligômeros de megadaltons que participam no transporte de oxigênio em múltiplos organismos invertebrados. Hemocianinas são usadas como imunoestimulantes naturais não tóxicos e inespecíficos com aplicações biomédicas e clínicas fundamentais; portanto, entender os mecanismos moleculares precisos das hemocianinas é essencial para a melhoria futuras dessas aplicações. Atualmente, a hemocianina mais bem estudada do ponto de vista estrutural e imunológico é a KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), de Megathura crenulate. Combinando-se cryo-EM e cristalografia de raios X, os detalhes atômicos das unidades funcionais que compõem o KLH foram revelados, exibindo anéis homodecaméricos altamente simétricos, com regiões extensivamente glicosiladas. Entretanto, hemocianinas homologas de outros organismos marinhos como o CCH tem demonstrado um grau significativo de diversidade estrutural, espacialmente em relação a padrões de glicosilação, que podem explicar a sua eficiência distinta em gerar resultados adjuvantes apropriados em terapias imunológicas orientadas. Caracterizações bioquímicas preliminares de CCH demonstraram a existência de duas cadeias polipeptídicas distintas, formando anéis heterodiméricos, contrário aos anéis homodiméricos do KLH. Cada subunidade de CCH aparenta possuir oito domínios globulares de ligações de oxigênio, denominados unidades funcionais (FU), que são glicosilados de forma diferenciada. Todavia, qualquer informação estrutural confirmada segue elusiva até o momento. Nesse contexto, nós propomos o objetivo primário de determinar a estrutura de CCH por cryo-EM de partículas isoladas. Buscamos combinar o acesso dos pesquisadores chilenos à espécimes de Concholepas concholepas e seu conhecimento especializado sobre a extração, biologia molecular e a bioquímica de HCC, com a nossa experiência em determinação estrutural de proteínas utilizando cryo-EM. Uma vantagem adicional do lado brasileiro é o acesso geográfico consideravelmente facilitado ao LNNano, que certamente facilitará a identificação inicial e refinamento das melhores condições de preparo de CCH, para posterior coleta no Titan Krios. Análises preliminares por microscopia eletrônica de coloração negativa do CCH, apresentadas aqui, aumentam as chances de sucesso desta proposta. Simultaneamente, o grupo chileno trabalha na identificação da sequência primaria do CCH e no entendimento da importância biológica de sua glicosilação. Importante, modificações pós-traducionais como a glicosilação podem ser atualmente observadas em mapas de cryo-EM. Os resultados obtidos neste projeto contribuirão para elucidar a estrutura e o mecanismo do CCH, além das suas propriedades biomédicas excepcionais. Ademais, a oportunidade de realizar esta... (AU)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

ELLENA, Matías Nahuel. Determinação estrutural, por cryo-EM, da hemocianina do molusco Concholepas concholepas com impacto biomédico substancial. 2023. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos (IFSC/BT) São Carlos.