Edição dos genes CSN2 (beta-caseína) e LGB (beta-lactoglobulina) por CRISPR/Cas9 em células de Bos taurus como modelo de produção de proteínas recombinantes

• Processo: 21/00388-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Patologia Animal
• Pesquisador responsável: Carlos Eduardo Ambrósio
• Beneficiário: Clesio Gomes Mariano Junior
• Instituição Sede: Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA). Universidade de São Paulo (USP). Pirassununga , SP, Brasil
• Assunto(s): Bovinos Proteína 9 associada à CRISPR Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas Edição de RNA
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: bovino | Cas9 | Crispr | edição gênica | Knock-in | knockout | Edição gênica

Resumo

A produção e comercialização de proteínas recombinantes é um mercado multibilionário em constante expansão. Devido às limitações dos modelos de produção em bactérias e leveduras foram surgindo métodos alternativos, como os baseados em células de mamíferos. Uma das abordagens mais promissoras neste sentido é a de produzir proteínas recombinantes nas glândulas mamárias de bovinos aproveitando toda a maquinaria molecular de expressão proteica no leite desses animais e substituindo as duas principais proteínas nele presentes, a beta-caseína (CSN2) e a beta-lactoglobulina (LGB) por outras proteínas de interesse comercial. Neste contexto, a presente proposta tem como objetivo principal o knockout dos genes CSN2 e LGB em modelo bovino pela tecnologia CRISPR/Cas9. Com a nova linhagem estabelecida, pretende-se por meio do knock-in introduzir uma sequência curta não-codificante a fim de validar a técnica e como prova de conceito. Inicialmente será realizada a padronização de todas as etapas de estratégias de edição gênica (desenho dos RNAs guia, construção do donor DNA e clonagem gênica). Posteriormente, as células serão transfectadas por meio do equipamento AMAXA NucleofectorTM 2B. Após dois dias em cultura, as células serão analisadas por citometria de fluxo para avaliar a taxa de transfecção. Em seguida, será realizado o sorting das células para geração dos clones em cultura. Estes clones serão cultivados, selecionados e avaliados por meio do sequenciamento Sanger para posterior análise da frequência de indels pelo programa Synthego ICE como validação do knockout e knock-in. Esta proposta potencialmente pode gerar um novo modelo de produção de proteínas recombinantes ao permitir a introdução de transgenes de interesse comercial e terapêutico em glândula mamária bovina.

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

CLÉSIO GOMES MARIANO JUNIOR; VANESSA CRISTINA DE OLIVEIRA; CARLOS EDUARDO AMBRÓSIO. Gene editing in small and large animals for translational medicine: a review. Animal Reproduction, v. 21, n. 1, 2024-04-19. (21/00388-5)