Edição de genes via multiplex CRISPR/Cas9- geração de BCG knockout não marcado compatível com o teste cutâneo DIVA

• Processo: 21/13879-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2022
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Luciana Cezar de Cerqueira Leite
• Beneficiário: Luana Moraes
• Supervisor: Johnjoe McFadden
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of Surrey, Inglaterra
• Vinculado à bolsa: 17/17218-0 - Implantação da plataforma de CRISPR-Cas9 em micobactéria: investigação do sistema ESX-1 na imunogenicidade de BCG, BP.DD
• Assunto(s): Tuberculose bovina Desenvolvimento de vacinas Vacinas Vacina BCG Diagnóstico precoce Controle de doenças Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas CRISPR-Cas9
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Bcg | Crispr | recombinante | Vacina | Desenvolvimento de vacinas

Resumo

A tuberculose (TB) é um problema de saúde global. Além da questão de saúde pública, a doença também é um problema econômico na pecuária. A vacinação é a estratégia mais econômica para o controle da TB. Até agora, a única vacina licenciada é a BCG, uma cepa viva atenuada do Mycobacterium bovis. Embora tenha várias vantagens, a proteção BCG diminui com o tempo, variando de 0 a 80% em adultos. O melhor cenário para o controle da doença é a combinação da vacinação e do diagnóstico precoce. Em bovinos, o controle da TB é baseado no teste e descarte, o que reforça a importância de um diagnóstico mais preciso. O teste tuberculínico (PPD) é usado atualmente, mas não distingue o BCG de outras micobactérias (patogênicas e ambientais). Foi desenvolvido um novo teste diagnóstico capaz de Diferenciar Animais Infectados de Vacinados (DIVA), baseado em antígenos imunodominantes presentes em M. bovis e ausentes em BCG; a inclusão de antígenos adicionais que se mostraram dispensáveis à persistência in vivo do bacilo exibiu sensibilidade aumentada. Um BCG KO compatível com DIVA deficiente desses antígenos foi construído por meio de um procedimento muito trabalhoso e demorado; será necessária a eliminação dos genes de resistência a antibióticos do genoma. Mostramos a eficiência e versatilidade do CRISPR / Cas9 para a geração de KOs não marcados. Propomos induzir múltiplos nocautes de genes para gerar uma cepa BCG KO não marcada compatível com DIVA. Esta cepa será transformada para obter a expressão do adjuvante LTAK63 para melhorar a proteção contra o desafio de MTB/BTB. (AU)