Análise da produção de hidroperóxidos orgânicos por células leucêmicas promielocíticas humanas (HL-60) em tempo real através do biossensor PxIII-roGFP2

• Processo: 23/08303-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2023
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Flavia Carla Meotti
• Beneficiário: Isadora Medeiros
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/14898-2 - Processos redox na inflamação e o seu papel sobre doenças inflamatórias, AP.JP2
• Bolsa(s) vinculada(s): 24/16691-7 - Análise e comparação da resposta do novo biosensor PxIII-roGFP2 em diferentes ambientes intracelulares, BE.EP.IC
• Assunto(s): Técnicas biossensoriais Inflamação
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: biossensores | Hidroperóxidos orgânicos | Inflamação | redox | Bioquímica redox

Resumo

A resposta inflamatória consiste na mobilização de diversos mecanismos celulares e moleculares diante da infecção ou lesão tecidual, a fim de cessar o dano cometido ao organismo. As células envolvidas nesse processo são responsáveis por produzir grandes concentrações de moléculas oxidantes, importantes para o combate a microrganismos e para a sinalização celular. É essencial conhecer a fundo o papel que essas moléculas executam em cada etapa da inflamação a fim de melhor compreender este processo em diferentes quadros clínicos. A presença de oxidantes e os processos celulares envolvidos em sua produção podem ser analisados utilizando biossensores geneticamente codificados, como aqueles derivados da proteína fluorescente roGFP2 (redox-sensitive Green Fluorescent Protein 2), cuja utilização é promissora visto que tal ferramental possui características estruturais que permitem a detecção em tempo real de oxidantes produzidos em células. Esta ferramenta tem sido amplamente utilizada para a detecção do peróxido de hidrogênio. Porém, para a detecção de peróxidos orgânicos, também produzidos de forma relevante na inflamação, nenhuma destas ferramentas tem sido explorada. Nesse trabalho, será realizada a caracterização do biossensor PxIII-roGFP2, obtido pelo fusionamento da proteína roGFP2 à enzima non-selenium glutathione peroxidase (PxIII) de Trypanosoma brucei, que tem ação semelhante à da enzima glutationa peroxidase, capaz de mediar a redução de hidroperóxidos fosfolipídicos. Neste sentido, este novo biossensor poderá ser uma ferramenta capaz de detectar hidroperóxidos orgânicos envolvidos no contexto inflamatório a nível intracelular. Desse modo, temos como primeiro objetivo a expressão e a purificação do biossensor PxIII-roGFP2, para, em seguida, caracterizar sua cinética com hidroperóxido de ácido linoleico. Como segundo objetivo, têm-se a purificação do plasmídeo pcDNA3.1 (vetor que transporta PxIII-roGFP2) seguido da transfecção de células leucêmicas promielocíticas humanas (HL-60) para que expressem em seu citoplasma o biossensor PxIII-roGFP2, que será utilizado na detecção de oxidantes produzidos pelas células ao diferenciá-las e ativá-las. Por fim, temos como terceiro objetivo avaliar o burst oxidativo em células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas, em grupos transfectados com a PxIII-roGFP2 e não transfectados, a fim de garantir que o biossensor não interfere nos processos celulares envolvidos na resposta inflamatória.