A contribuição de AP-1gamma2 e PI3KC2alfa para a maturação do endossomo inicial para endossomo tardio, secreção de vesículas extracelulares e biogênese de organelas relacionadas ao lisossomo

• Processo: 23/12126-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 29 de fevereiro de 2024
• Data de Término da vigência: 27 de fevereiro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular
• Pesquisador responsável: Luis Lamberti Pinto da Silva
• Beneficiário: Lucas Alves Tavares
• Supervisor: Graça Raposo
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Institut Curie, França
• Vinculado à bolsa: 21/01182-1 - A caracterização funcional de AP-1 no sistema endolisossomal e sua relação com a montagem de HIV-1, BP.PD
• Assunto(s): Vesículas extracelulares Lisossomos Endossomos Biogênese de organelas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Ap-1 | AP-1gamma2 and PI3KC2alpha | Biogênese dos lisossomos | melanossomos | Tráfego de proteínas | vesículas extracelulares | Tráfego intracelular de proteinas

Resumo

Os complexos de proteína adaptadora (AP) são complexos heterotetraméricos que coordenam o tráfego de proteínas nas vias endocítica e secretora. Acredita-se que AP-1, um complexo de quatro subunidades distintas (gamma, beta1, mi1, and alfa1), medeie o tráfego de proteínas entre a rede trans-Golgi (TGN) e os endossomos e as Organelas Relacionadas aos Lisossomos (LROs) por meio de vesículas revestidas de clatrina (CCV). O genoma humano codifica duas isoformas da subunidade gamma-adaptina (gamma1 e ³2) que formam duas variantes de AP-1 (AP-1gamma1 e AP-1gamma2). Estudos anteriores demonstraram que gamma2 pode formar uma variante do complexo AP-1, mas o conhecimento é limitado em relação aos papéis celulares desempenhados por este complexo alternativo de AP-1. Relatamos anteriormente que gamma2 faz parte de uma variante funcional do complexo AP-1 utilizada por HIV-1 Nef para direcionar CD4 e MHC-I para degradação lisossomal. Além disso, nossos dados anteriores sugerem que o AP-1gamma2 pode estar envolvido na maturação dos endossomos e na biogênese e secreção das vesículas extracelulares (EVs), possivelmente através da alteração do tráfego de seu parceiro de ligação PI3KC2alfa. No entanto, os mecanismos exatos que governam essas alterações permanecem não elucidados. Neste projeto, propomos investigar a participação de AP-1gamma2 e PI3KC2alfa na dinâmica do sistema endo-lisossomal. Nossa hipótese é que AP-1gamma1 e AP-1gamma2 são provavelmente recrutados para diferentes compartimentos subcelulares da célula e isso pode explicar suas diferentes funções. Para esclarecer ainda mais as funções dessas diferentes isoformas, utilizaremos tecnicas complementares. Em particular, realizaremos imunofluorescência indireta seguida de microscopia de super resolução e microscopia eletrônica de células HeLa para comparar a distribuição subcelular de AP-1gamma1, AP-1gamma2 e PI3KC2alfa. Para entender melhor as alterações morfológicas dos endossomos iniciais e tardios em células WT e células knockout (KO) gamma2, realizaremos adicionalmente microscopia eletrônica convencional após congelamento de alta pressão para preservar de forma ideal a morfologia destas estruturas. Além disso, desenvolveremos células KO PI3KC2alfa pela metodologia CRISPr-Cas9 para investigar se a depleção de PI3KC2alfa simula as alterações na maturação do endossomo e na biogênese e secreção de EV observadas em células gamma2 KO. Finalmente, pretendemos expandir nosso conhecimento adquirido até agora sobre gamma2 e PI3KC2alfa para investigar suas funções em células especializadas (melanócitos da pele) gerando LROs (melanossomas). Estudaremos se a depleção de gamma2 e PI3KC2alfa em melanócitos pigmentados comprometerá a biogênese dos melanossomas, a LRO mais bem caracterizada e para a qual foi relatada uma função de AP-1. Portanto, o estudo proposto tem o potencial de contribuir para a compreensão de processos fundamentais na regulação do tráfego de proteínas envolvidas na maturação dos endossomos iniciais e tardios, bem como na secreção de EVs e na biogênese de LROs. (AU)