A caracterização funcional de AP-1 no sistema endolisossomal e sua relação com a montagem de HIV-1

• Processo: 21/01182-1
• Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Vigência (Início): 01 de julho de 2021
• Vigência (Término): 30 de junho de 2023
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular
• Pesquisador responsável: Luis Lamberti Pinto da Silva
• Beneficiário: Lucas Alves Tavares
• Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Proteínas adaptadoras de transporte vesicular HIV-1 Interações hospedeiro-patógeno Interação proteína-proteína Fosfatidilinositol 3-quinases

Resumo

A biogênese das organelas do sistema endolisossomal depende de múltiplas rotas de transporte partindo do complexo de Golgi e da membrana plasmática que são responsáveis pela entrega de proteínas e lipídeos aos compartimentos deste sistema. Um grupo de proteínas de transporte envolvido no funcionamento da via endolisossomal é formado por cinco proteínas adaptadoras (APs). APs são complexos heterotetraméricos que medeiam a seleção da carga e a formação da capa vesicular para o tráfego de proteínas entre diferentes organelas do sistema de endomembranas. AP-1 e AP-4 localizam-se na rede trans-Golgi (TGN), AP-2 na membrana plasmática, AP-3 nos endossomos primários e AP-5 em endossomos tardios, e estes complexos encaminham carga a partir destas localidades. Cada complexo é formado por duas subunidades grandes (³ e ²1 para AP-1, ± e ²2 para AP-2, ´ e ²3 para AP-3, µ e ²4 para AP-4, ¶ e ²5 para AP-5), uma média (¼1- ¼5) e uma pequena (Ã1- Ã5). AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes, incluindo duas subunidades ³ (³1 e ³2), duas ¼1 (¼1A e ¼1B) e três Ã1 (Ã1A, Ã1B e Ã1C) para AP-1. A combinação de diferentes isoformas das subunidades pode, em teoria, gerar pelo menos doze complexos de AP-1. Resultados anteriores do nosso grupo de pesquisa indicam que as subunidades ³1 e ³2 definem complexos AP-1 com funções distintas no tráfego intracelular. Entretanto, as rotas de transporte controladas por essas variantes de AP-1 ainda não foram precisamente definidas. Dessa forma, este projeto procura identificar e caracterizar diferencialmente o papel de AP-1³2 e de AP-1³1, no tráfego intracelular de proteínas no sistema endolisossomal em um contexto fisiológico e em um contexto de relação patógeno-hospedeiro. Primeiramente investigaremos a possível função de AP-1³2 na maturação endossomal via interação com a fosfatidilinositol 3-quinase 2 alfa (PI3KC2±). Para tal, iremos verificar se o knockdown (KD) de AP-1³2 ou de PI3KC2± acarreta na mudança da localização subcelular destas proteínas por meio de microscopia e fracionamento subcelular. Ademais, iremos mapear os sítios de interação entre PI3KC2± e AP-1³2 e verificar se os mesmos são importantes para a distribuição e função dessas proteínas na célula. Em um segundo momento, iremos verificar o possível papel de AP-1³2 no tráfego intracelular dos receptores de Cu+ (ATP7A e ATP7). Neste contexto, testaremos se ATP7A e ATP7B interagem fisicamente com AP-1³2, além de investigar se o KD de AP-1³2 compromete o transporte de ATP7A e ATP7B entre o TGN e os endosomos. Como terceiro objetivo, iremos investigar o possível papel de AP-1 na montagem e externalização das partículas virais de HIV-1. Dessa forma, iremos monitorar o tráfego intracelular de Env de HIV-1 desde sua síntese no RE até a membrana plasmática através do sistema RUSH (Retention Using Selective Hooks), permitindo estudar de forma inovadora como Env se relaciona à Gag de HIV-1. Ademais, iremos verificar se AP-1³2 é capaz de interagir com a cauda citosólica de Env (gp41CT) através de ensaios de interação proteína-proteína. Por fim, iremos investigar se a expressão das subunidades de AP-1 (AP-1³1, AP-1³2 ou AP-1¼1A) é necessária para: 1) a incorporação de Env e Gag nas partículas virais de HIV-1; 2) a correta localização de Env na membrana plasmática e; 3) a produção de partículas virais infecciosas. Dessa forma, o estudo proposto tem o potencial de contribuir para o entendimento de processos fundamentais na biogênese das partículas virais de HIV-1, além de buscar elucidar aspectos, ainda desconhecidos, de como esse vírus manipula fatores celulares para evadir o sistema imune. Em conjunto, o estudo proposto tem o potencial de contribuir para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas no sistema endolisossomal. (AU)