Caracterização de vias de tráfego de proteínas envolvidas na biogênese e funcionamento de lisossomos em células humanas

Resumo

A biogênese das organelas do sistema endo-lisossomal está ligada às múltiplas rotas de transporte partindo do complexo de Golgi e da membrana plasmática que são responsáveis pela entrega de proteínas e lipídeos aos compartimentos deste sistema. Neste contexto, algumas moléculas são essenciais para o correto controle e funcionamento deste tráfego, como as Rab5 e Rab7, envolvidas na maturação de endossomos primários em endossomos tardios, Alix e LBPA, envolvidas na biogênese das vesículas intraluminais (ILVs) dos corpos multivesiculares (MVBs), e a maquinaria ESCRTs (Endosomal-Sorting Complexes Required for Transport), que também contribui para a formação dos ILVs dos MVBs, além de coordenar a seleção de moléculas para a degradação lisossomal. Um outro grupo de proteínas envolvido no funcionamento das organelas e nas vias supracitadas são as proteínas adaptadoras (APs). Os APs são complexos heterotetraméricos que medeiam a seleção da carga e a formação da capa vesicular para o transporte de proteínas entre diferentes organelas do sistema de endomembranas. AP-1 e AP-4 localizam-se no trans-Golgi, AP-2 na membrana plasmática, AP-3 nos endossomos primários e AP-5 em endossomos tardios, e estes complexos encaminham carga a partir destas localidades. Cada complexo contém duas subunidades grandes (³ e ²1 para AP-1, ± e ²2 para AP-2, ´ e ²3 para AP-3, µ e ²4 para AP-4, ¶ e ²5 para AP-5), uma média (¼1- ¼5) e uma pequena (Ã1- Ã5). AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes, incluindo duas subunidades ³ (³1 e ³2), duas ¼1 (¼1A e ¼1B) e três Ã1 (Ã1A, Ã1B e Ã1C) para AP-1; duas ± (±A e ±C) para AP-2; e duas ²3 (²3A e ²3B), duas ¼3 (¼3A e ¼3B) e duas Ã3 (Ã3A e Ã3B) para AP-3. A combinação de diferentes isoformas das subunidades pode, em teoria, gerar pelo menos doze complexos de AP-1, quatro de AP-2 e oito de AP-3. Entretanto, existem poucos estudos para demonstrar se estas diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. Dessa forma, este presente trabalho procura identificar e caracterizar diferencialmente o papel de ³2 e de ³1, subunidades de AP-1, no tráfego intracelular de proteínas no sistema endo-lisossomal. Neste contexto, primeiramente buscaremos desenvolver células knockout para ³2 e ³1 através da tecnologia CRISPR/Cas9 e posteriormente analisaremos o papel de ³2 e ³1 na biogênese dos MVBs. Para isto, verificaremos nestas células a razão entre o número de estruturas endossomais positivas para Rab5 ou para Rab7 em células knockout para ³2 e ³1 por imunofluorescência indireta, bem como os níveis de componentes dos ESCRTs por western-blot. Além disso, buscaremos entender a função de ³2 e ³1 no funcionamento dos lisossomos, verificando nestas células knockout se a depleção destas moléculas acarreta na alteração do tráfego de hidrolases e receptores de hidrolases por imunofluorescência indireta, bem como verificar a morfologia dos lisossomos e MVBs por microscopia eletrônica através de imunomarcação de proteínas lisossomais de membrana. Adicionalmente, iremos caracterizar a participação das isoformas de ³-adaptina no contexto da infecção de HIV-1. Nossos achados ainda não publicados revelaram que a depleção de ³2 ou de ³1 acarreta em fenótipos distintos no comprometimento da diminuição dos níveis de CD4 e de HLA-A2 induzidos pela proteína viral Nef de HIV-1. Dessa forma, iremos realizar o silenciamento de ³1 e de ³2 por shRNA em linfócitos primários e analisaremos os níveis celulares totais por western blot e os níveis na membrana plasmática por citometria de fluxo de CD4 e de HLA-A2 durante a infecção por HIV-1. A melhor compreensão destes processos revelará aspectos relevantes, ainda desconhecidos, de como Nef de HIV-1 subverte fatores celulares para reduzir a expressão de moléculas importantes do sistema imune. Em adição, o estudo proposto tem o potencial de contribuir para o ent