Investigação dos papéis diferencias das duas variantes de complexos de adaptadores de proteína 1 (AP-1) no tráfego de proteínas

Resumo

Os complexos de proteínas adaptadoras (AP) são complexos heterotetraméricos que coordenam o tráfego de proteínas nas vias endocíticas e secretoras. Acredita-se que AP-1, um complexo formado por quatro subunidades distintas (³, ²1, ¼1 e Ã1), medeiam o tráfego de proteínas entre a rede trans-Golgi (TGN) e endossomos através de vesículas revestidas de clatrina (CCV). Especificamente, o AP-1 está envolvido no tráfego adequado de receptores de manose-6-fosfato (MPRs), que transferem hidrolases ácidas recém sintetizadas do TGN para endossomos para a sua subsequente transferência para os lisossomas. O genoma humano codifica duas isoformas da subunidade ³-adaptina (³1 e ³2) que formam duas variantes de AP-1 (AP-1³1 e AP-1³2). No entanto, o papel específico dessas variantes do AP-1 no tráfego de MPRs não é bem descrito. Os nossos dados preliminares indicam que o AP-1³1 está mais provavelmente envolvido no tráfego anterógrado de moléculas de MPR-cátion independente (CI) do TGN para endossomos, enquanto o AP-1³2 parece ser dispensável para esta via de transporte. Em vez disso, nossos dados preliminares sugerem que o AP-1³2 poderia estar envolvido no transporte retrógrado do CI-MPR de volta ao TGN. Aqui propomos investigar os papéis diferenciais do complexo AP-1³1 e AP-1³2 no tráfego de proteínas dentro do sistema endo-lisossomal. Portanto, gostaríamos de realizar imunomicroscopia eletrônica (EM) de células HeLa para comparar a distribuição subcelular de AP-1y1 e AP-1³2, bem como determinar a localização subcelular de CI-MPR em células depletadas de AP-1³1 ou AP- 1³2 por RNAi. Além disso, para ampliar o conhecimento dos papéis de AP-1³1 ou AP-1³2 no tráfego de proteínas, propomos 1) identificar novos parceiros de interação de AP-1³1 e AP-1³2 em células Hela usando a técnica BioID seguida por espectrometria de massa e 2) para comparar a composição proteica das fracções de vesículas revestidas de clatrina (CCV) do controle e as células AP-1y1 ou AP-1y2. O trabalho aqui proposto complementa meus estudos de pós-graduação financiados pela FAPESP (2016/18207-9) e contribuirá para melhor compreensão da função de AP-1³1 e AP-1³2 no tráfego de proteínas. (AU)