Caracterização funcional de genes do proteassoma de Leishmania infantum

• Processo: 24/17027-3
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2024
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Felipe Roberti Teixeira
• Beneficiário: Mariele Cristina de Carvalho
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 22/02933-3 - Papel do sistema ubiquitina proteassoma na proliferação, diferenciação e infectividade de Leishmania infantum, AP.PNGP.PI
• Assunto(s): Leishmania infantum Complexo de endopeptidases do proteassoma Parasitologia molecular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: leishmania infantum | Proteassoma | Parasitologia Molecular

Resumo

O trabalho a ser desenvolvido pelo TT4-A inclui a geração de 27 mutantes nulos de L. infantum através de do nocaute de todas as subunidades do proteassoma por CRISPR-Cas9 adicionando uma sequencia nucleotídica única (barcode). Serão avaliadas nas linhagens viáveis o efeito no nocaute na atividade do proteassoma por meio de bioluminescência. Utilizando-se um sensor desenvolvido em nosso grupo que contém uma luciferase fusionada com peptídeos direcionadores para proteólise (CL1 ou MODC). As linhagens viáveis serão reunidas em uma única cultura promastigota (pooled culture) que será cultivada em diferentes tempos (0, 24, 48 e 168h), diferenciadas em amastigotas (24 e 72h) ou usadas para infecção in vitro (12 e 72h). Estes ensaios serão realizados em sextuplicata e, portanto teremos 48 amostras que serão submetidas a sequenciamento em plataforma Illumina. Para isso, o DNA dos parasitos será extraído e utilizado como template para reações de PCR usando os primers específicos para amplificação das sequencias contendo os barcodes, que após purificação serão usados para produção de bibliotecas de amplicons que serão usadas em kit Illumina para posterior sequenciamento. As sequencias geradas serão analisadas buscando as sequencias de 12pb que precedem os barcodes. Quando encontradas, as reads serão contadas e a sequencia barcode vai identificar o gene nocauteado. O total de cada barcode único será gerado e o fitness relativo dos mutantes nulos de cada variável estudada será calculado pelo número de reads do barcode único dividido pelo total de reads de todos os barcodes daquela amostra. O aumento ou diminuição do fitness de cada mutante nulo será obtido pela comparação com a amostra adjacente do desenho experimental. Neste projeto serão comparadas as seguintes amostras: promastigotas 0 e 24h; 48 e 168h; 168h com amastigotas 24h; e amastigotas 24h e 120h. Além destes, também serão analisados: promastigotas 168h com metacícilocos purificados; metacíciclos purificados e infecção 24h; e infecção 24 e 72h.