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Caracterização funcional dos ligantes das proteínas SKP1 e CUL1 de Leishmania infantum por bar-seq/CRISPR-Cas9

Processo: 23/07201-3
Modalidade de apoio:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de outubro de 2024
Vigência (Término): 30 de setembro de 2025
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Felipe Roberti Teixeira
Beneficiário:Camila Rolemberg Santana Travaglini Berti de Correia
Supervisor: Richard McCulloch
Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
Local de pesquisa: University of Glasgow, Escócia  
Vinculado à bolsa:21/10971-0 - Caracterização bioquímica das E3 ubiquitina-ligases do tipo CRL (Cullin RING-ligases) em Leishmania infantum, BP.DD
Assunto(s):CRISPR-Cas9   Leishmania infantum   Parasitologia molecular   Caracterização funcional   Via da ubiquitina-proteassoma
Palavra(s)-Chave do Pesquisador:Bar-seq | CRISPR-Cas9 | Cul1 | leishmania infantum | Skp1 | Parasitologia molecular

Resumo

O sistema ubiquitina proteassoma (SUP) é o maior responsável pela proteólise intracelular em eucariotos e o processo de ubiquitinação ocorre pela ação de três enzimas: E1 (enzima ativadora de ubiquitina), E2 (enzima carreadora de ubiquitina) e E3 (ubiquitina-ligases) que desempenham um papel fundamental neste processo, reconhecendo e transferindo a ubiquitina para o seu substrato. Em protozoários parasitas, a proteólise intracelular é essencial para a alternância de hospedeiros em seus ciclos de vida e consequentemente para o sucesso do parasitismo. O proteassoma Leishmania tem uma alta identidade ao de mamíferos, sendo considerado um alvo para o tratamento da leishmaniose, porém pouco é conhecido sobre SUP no gênero Leishmania. Meu projeto de doutorado pretende caracterizar os genes ortólogos aos humanos SKP1, RBX1 e CUL1 de Leishmania infantum, que são componentes das E3 ligases mais estudadas em humanos chamadas CRL (Cullin-RING ligases). Nós mostramos através de imunoprecipitação em células de mamíferos a interação entre componentes de CRLs de L. infantum com seus respectivos parceiros ortólogos humanos, indicando que os motivos responsáveis pela interação são conservados, sugerindo a presença do complexo CRL em L.infantum. Parasitas promastigotas foram geneticamente modificados através da estratégia CRISPR-Cas9 para gerar linhagens de L. infantum com SKP1 e Cullin1 em fusão com 3xmyc-mCherry e os extratos dessas linhagens para desenvolver imunoprecipitação com beads anti-myc. Os eluatos foram analisados por espectrometria de massas e o interactoma SKP1 revelou 43 proteínas parceiras, incluindo Cullin1, RBX1 e 6 proteínas com domínio F-box. S, as proteínas que interagem com Cullin1 incluem SKP1, RBX1 e uma proteína F-box entre 22 proteínas parceiras. O objetivo desta proposta BEPE é caracterizar funcionalmente o interactoma SKP1 e CUL1 identificado em L.infantum. Para isso, colaboramos com o Dr. Richard McCulloch, cujo grupo é especializado em análise gênica em larga escala em parasitas, e propusemos nocautear e inserir um bar-seq com sequência nucleotídica única individualmente cada um dos nocautes em L. infantum. Os mutantes nulos viáveis serão agrupados em uma cultura e ensaios de proliferação de promastigotas, diferenciação de amastigotas, ciclo celular e a morfologia de L. infantum serão avaliados. Mutantes não viáveis serão selecionados para serem estudados por nocaute condicional. Além disso, SKP1, CUL1 e suas proteínas parceiras serão avaliadas por co-localização celular no microscópio de super-resolução Elyra 7. Assim, esta oportunidade será essencial para o projeto de doutorado em andamento e me dará experiência para aplicar estudos genéticos em larga escaça para caracterização do parasita em nosso grupo no Brasil. (AU)

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