Avaliação do papel das proteínas MRE11, EXO1 e BLM na ressecção do DNA e variação antigênica em Trypanosoma brucei.

• Processo: 24/14590-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2024
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Maria Carolina Quartim Barbosa Elias Sabbaga
• Beneficiário: Ricardo Obonaga Gómez
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 20/00694-6 - Como o processo de replicação do DNA contribui para o sucesso da infecção causada por Trypanosoma cruzi, AP.TEM
• Assunto(s): Variação antigênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Blm | Exo1 | Mre11 | Quebra de dupla fita (DSB) | Resecção do DNA | Variação antigênica | Metabolismo do DNA em Tripanossomatídeos

Resumo

Estudos recentes em células humanas mostraram que o início da replicação pode ser mutagênico, com mutações como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e pequenas inserções/deleções (Indels) ocorrendo nas origens de replicação. Essas mutações estão ligadas à formação de quebras de DNA (DSBs) no centro da origem, seguidas pelo reparo do DNA propensa a erros à medida que as forquilhas de replicação se afastam das origens. Os dados que evidenciam esse cenário incluem um aumento local DSBs nas origens ativas, acumulação da topoisomerase II (TOPII) e colocalização de fatores que promovem o reparo por ligação mediada por microhomologia (MMEJ) enriquecidos nas origens.Resultados do nosso grupo, obtidos através das metodologias de Chip-seq, MFAseq e D-NAscent mostraram enriquecimento de origens de replicação ativas em famílias multigênicas em Trypanosoma cruzi, sendo que as origens frequentes, aquelas que ativam em um grande número de células, encontram-se enriquecidas em genes da família multigência DGF-1. Adicionalmente, genes da família DGF-1 contendo origens de replicação apresentam um maior número de SNPs do que aqueles sem origens de replicação. Assim, nós estamos trabalhando com a hipótese de que estresse replicativo ou processos abortivos da topoisomerase II (TOPII) podem resultar em danos no DNA como as DSBs, influenciando a variabilidade genética por meio dos mecanismos de reparo.Nas células eucariotas, as DSBs resultantes do estresse de replicação podem ser reparadas por NHEJ, assim como por mecanismos de reparo que utilizam sequencias de recombinação, como a recombinação homologa (HR) e MMEJ. Na ausência de evidências de um mecanismo funcional de reparo das DSB por NHEJ nos tripanossomatídeos, o reparo destas DSBs seria sustentando por HR e MMEJ.Trabalhos recentes destacam um papel cada vez mais relevante do reparo por MMEJ na regulação das forquilhas de replicação. Considerando que podem existir duas vias de reparo por MMEJ - uma que depende da Pol¸, da ligase III e de micro-homologias preexistentes em torno da quebra, e outra que não requer microhomologias preexistentes, podendo, em vez disso, contar com a ligase I, onde se propõe que as microhomologias poderiam ser geradas por uma atividade de polimerase operando em uma extremidade do DNA - acreditamos que o reparo por MMEJ poderia estar contribuindo para a regulação das forquilhas de replicação no Trypanosoma cruzi, como sugere a presença de mutagêneses como os SNPs. Corroborando com nossa hipótese que de MMEJ é o reparo envolvido com a forquilha de replicação, existe o fato de termos encontrado a porção catalítica de Pol¸ interagindo com Orc1Cdc6, marcador de origem de replicação em T. cruzi.Antes do reparo, as extremidades resultantes das quebras precisam ser modificadas por meio de um processo conhecido como ressecção do DNA terminal. Esse processo gera DNA de fita simples 3', necessário para diferentes tipos de reparo mediados por sequências de recombinação. A ressecção das DSBs é iniciada pela nuclease MRE11, que realiza uma ressecção de curto alcance e promove o reparo por MMEJ. Em seguida, a ressecção realizada pela MRE11 é complementada por uma ressecção de longo alcance pelas nucleases EXO1 ou helicase/nuclease DNA2/BLM. A importância da ressecção reside no fato de que esse processo regula a escolha da via de reparo a ser utilizada para as DSBs.Vamos aproveitar que dispomos de células de T. brucei que permitem interferir com as principais proteínas envolvidas na ressecção do DNA, como MRE11, BLM e EXO1. Essas células também permitem a geração controlada de uma DSB específica no cromossomo interno ou na região subtelomérica por meio da meganuclease I-SceI, permitindo explorar o papel dessas proteínas na ressecção do DNA e na variação antigênica. Assim, os resultados obtidos a partir desse modelo oferecerão uma visão geral do papel dessas proteínas na ressecção do DNA, que poderá ser usada também para entender esses processos em T. cruzi.