Treinamento em manipulação e cultura de Cryptococcus sp: métodos de análise de componentes da parede celular, purificação de vesículas extracelulares e infecção experimental em Galleria mellonella

• Processo: 24/17879-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Estímulo a Vocações Científicas
• Data de Início da vigência: 17 de fevereiro de 2025
• Data de Término da vigência: 05 de abril de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Biologia e Fisiologia dos Microorganismos
• Pesquisador responsável: Marcio Lourenço Rodrigues
• Beneficiário: Mariana Eberle dos Santos
• Instituição Sede: FIOCRUZ PARANA INSTITUTO CARLOS CHAGAS/FIOCRUZ
• Assunto(s): Micologia Cryptococcus Parede celular Vesículas extracelulares Infecção experimental Galleria mellonella
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cryptococcus | infeccao | Parede celular | vesículas extracelulares | Micologia

Resumo

O projeto de iniciação científica da estudante Mariana Eberle prevê o estudo do metabolismo primário, em especial o metabolismo lipídico, em Paracoccidioides brasiliensis. Resultados preliminares do grupo de origem, em que foi feita proteômica de leveduras após 24 h de inibição da calcineurina, uma fosfatase dependente de cálcio e calmodulina, com ciclosporina A (CSA), sugerem que o fungo esteja em vigorosa reprogramação metabólica. Esta hipótese se baseia no fato de que há uma alteração do padrão de corpúsculos lipídicos nas células, que diminuem de tamanho, sugerindo que as leveduras precisem lançar mão desta fonte de carbono para se adaptar ao estresse. Ao mesmo tempo, enzimas do metabolismo de lipídios, proteínas e carboidratos foram identificadas com sua abundância relativa alterada pela inibição da calcineurina, com o aparente comprometimento da glicólise e gliconeogênese, ciclo do ácido cítrico, ciclo do glioxilato e beta-oxidação.Ainda, embora sejam observações empíricas realizadas durante experimentos de extração de proteínas, leveduras tratadas com CSA precisam ser centrifugadas em velocidade maior e por mais tempo do que leveduras não tratadas, além de aparentarem maior rigidez de sua parede celular quando realizada lise mecânica, o que sugere alteração de componentes da parede. A hipótese é que a reprogramação metabólica observada pela inibição da calcineurina, ao afetar o metabolismo primário de carboidratos, leve a alterações de componentes glicanos da parede celular. Assim, considerando a expertise e histórico do grupo do Prof. Márcio Rodrigues na área de glicobiologia, como objetivo e plano de trabalho para este estágio de treinamento, é proposto aprender técnicas de análise de componentes de parede celular no modelo de Cryptococcus. Com isso, pretende-se também que a estudante obtenha treinamento no manuseio e manutenção de culturas de Cryptococcus, bem como técnicas de isolamento de vesículas extracelulares (EV) deste fungo, para posteriormente aplicar em P. brasiliensis.No retorno ao laboratório de origem, além das análises de componentes de parede celular no modelo de P. brasiliensis, pretende-se também seguir com a avaliação do conteúdo de glicanos e enzimas de remodelamento de componentes de parede celular nas EV de micélios e leveduras tratadas com diferentes concentrações de CSA. Ainda, objetiva-se aprender técnicas de manutenção de colônias de Galleria mellonella para infecção futura com P. brasiliensis, como modelo para testar a ação de componentes de parede celular e conteúdo glicanos de EV purificadas de fungos na virulência e infecção neste modelo.Este aprendizado contribuirá para o projeto de mestrado futuro da estudante, que será dedicado a estudar aspectos do metabolismo primário de carbono relacionado à adaptação do fungo a situações de estresse, como o causado pela inibição da calcineurina. Como a calcineurina está relacionada com a adaptabilidade a condições de estresse em diferentes fungos, e acreditando que a capacidade de adaptação ao ambiente interno do hospedeiro é o que garante o sucesso da infecção, demonstrar uma possível ação da calcineurina sobre o controle do conteúdo e/ou liberação de EV pode revelar moléculas importantes (enzimas de remodelamento de parede celular e glicanos) para a virulência.