Elucidação do mecanismo regulatório e estrutural da GDP-manose pirofosforilase (GMP) e sua interação com as enzimas Kjc-1/Kjc2 e seu papel na biossíntese do ácido ascórbico

• Processo: 24/21019-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2025
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Andre Luis Berteli Ambrosio
• Beneficiário: Grazieli Moreira Cordeiro
• Instituição Sede: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Cristalografia de raios X Enzimas Microscopia eletrônica Vitamina C Biologia estrutural
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cristalografia de raios X | enzima | Microscopia Eletrônica | vitamina C | Biologia Estrutural

Resumo

O ácido ascórbico (AsA), ou vitamina C, é uma molécula multifuncional com funções cruciais no controle redox celular em plantas e animais. Entre as plantas, destaca-se a espécie amazônica Myrciaria dubia (camu-camu), que apresenta níveis excepcionais de AsA, variando de 1 a 3 g por 100 g de polpa, sendo assim uma fonte promissora para aplicações nutracêuticas e biotecnológicas. Em plantas, a biossíntese de AsA ocorre majoritariamente pela via de Smirnoff-Wheeler, que converte glicose-6-fosfato em ácido ascórbico em várias etapas enzimáticas. A enzima GDP-manose pirofosforilase (GMP) desempenha um papel crítico nesse processo, catalisando a formação de GDP-manose a partir de GTP e manose-1-fosfato, um precursor essencial para a produção de L-galactose, que é convertida a seguir em AsA. Assim, a atividade e a regulação da GMP impactam diretamente o fluxo de metabólitos nessa via e, consequentemente, os níveis de AsA na planta. Embora a via de Smirnoff-Wheeler seja bem descrita, os mecanismos regulatórios e estruturais que controlam a atividade da GMP e, especificamente, o papel das proteínas Kjc-1 e Kjc-2 como ativadoras da GMP, ainda são pouco compreendidos. Este projeto visa elucidar esses mecanismos regulatórios e estruturais da GMP e das proteínas Kjc-1 e Kjc-2, oferecendo insights sobre o controle da biossíntese de AsA. Para tanto, as sequências gênicas das enzimas foram otimizadas, sintetizadas e clonadas nos vetores pET28a+ e pET-Duet. A expressão das proteínas recombinantes será realizada na cepa Rosetta BL21 (DE3), com indução de 0,3 mM de IPTG, seguida de purificação por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. A caracterização bioquímica será conduzida com substratos específicos sob condições controladas de pH, temperatura e tampão. A análise estrutural das interações entre GMP, Kjc-1 e Kjc-2 será realizada usando ferramentas bioinformáticas, cristalografia de raios-X e criomicroscopia eletrônica (crio-EM), permitindo uma compreensão detalhada da ativação da GMP por Kjc-1 e Kjc-2 e do controle da via de biossíntese de AsA em plantas.