Estudo funcional do gene ehmt2 (candidato para uma nova síndrome kleefstra-like)

• Processo: 25/00171-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 29 de maio de 2025
• Data de Término da vigência: 28 de maio de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
• Pesquisador responsável: Ana Cristina Victorino Krepischi
• Beneficiário: Laura Machado Lara Carvalho
• Supervisor: Maria Jose Barrero Nuñez
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Institut de Salud Carlos III, Majadahonda, Espanha
• Vinculado à bolsa: 22/03980-5 - Estudo genômico e funcional de formas sindrômicas de deficiência intelectual, BP.PD
• Assunto(s): Proteína 9 associada à CRISPR Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas Deficiência intelectual
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas9 | ChIP-seq | Crispr | Deficiencia intelectual | Ehmt2 | Organoides cerebrais | síndrome de Kleefstra | Deficiência intelectual; neurodesenvolvimento

Resumo

No meu projeto de pós-doutorado, um dos objetivos é investigar a variante de sítio de splice c.328+2T>G no gene EHMT2, identificada em homozigose em uma paciente com deficiência intelectual sindrômica. Verificamos que a paciente apresenta uma assinatura epigenética compatível com a validada para pacientes com variantes patogênicas em EHMT1 (síndrome de Kleefstra 1). Através de RNAseq, identificamos o uso de dois sítios doadores de splicing crípticos localizados no exon 3, sem detecção de transcritos do tipo selvagem. A presença de uma isoforma com deleção inframe pode explicar a viabilidade dessa mutação homozigota. Acreditamos que a mutação não cause perda total da função de EHMT2, sugerindo a existência de isoformas alternativas. Em conjunto, os dados clínicos, genéticos e epigenéticos indicam um mecanismo LoF para a variante, apontando o gene EHMT2 como um novo candidato para uma síndrome Kleefstra-like com padrão recessivo de herança. Esses resultados foram reportados em um artigo recentemente publicado na Molecular Neurobiology, no qual a Dra. Barrero é coautora.Atualmente, a Dra. Barrero trabalha em estudos funcionais propondo que mutações missense heterozigotas no gene EHMT2 também possam levar a uma síndrome Kleefstra-like, porém sob um modelo dominante de herança, quando mapeadas no domínio SET, que tem atividade metiltransferase. Em um artigo de preprint, a Dra. Barrero e colaboradores apresentam a hipótese e evidências funcionais baseadas em caso com a variante missense p.Ala1077Ser em heterozigose. Essa variante comprometeu a afinidade para a cauda de H3, levando a uma redução de três a cinco vezes na atividade enzimática de EHMT2. Além disso, o ensaio EpiSign revelou um perfil semelhante ao observado na síndrome de Kleefstra 1. Análises de metilação de histonas por espectrometria de massas e de RNAseq mostraram considerável sobreposição entre culturas de fibroblastos com a variante p.Ala1077Ser de EHMT2 e uma variante patogênica de EHMT1 (p.His620ThrfsTer12). Com isso, foi proposto um padrão de herança dominante devido à mutação missense de EHMT2 com mecanismo de haploinsuficiência em decorrência de uma redução da atividade enzimática, embora um efeito dominante negativo não possa ser descartado. Além do paciente relatado no artigo de preprint, a Dra. Barrero identificou, por meio de colaborações, seis outras variantes missense heterozigotas promissoras no domínio SET em pacientes com características clínicas semelhantes à Kleefstra. Sua equipe está desenvolvendo modelos celulares utilizando iPSCs desses pacientes e trabalhando em sua caracterização.Pretendo passar um ano no grupo da Dra. Barrero, com o objetivo de investigar modelos celulares derivados de sete pacientes com sobreposição clínica com a síndrome de Kleefstra e variantes em heterozigose no domínio SET de EHMT2. Além disso, planejo adicionar o nosso modelo celular baseado nas células iPSC da paciente com a mutação c.328+2T>G em homozigose a esse estudo em andamento da Dra. Barrero.Durante o estágio no exterior, terei a oportunidade de aprender e trabalhar com as seguintes metodologias:i) Desenvolvimento e caracterização de organoides cerebrais com mutações em EHMT2;ii) Avaliação in vitro da atividade enzimática de EHMT2;iii) Avaliações das marcas de histonas por ChIP-Seq;iv) Correção de variantes por CRISPR-Cas9 para avaliar o possível resgate do fenótipo selvagem.