Planejamento, expressão, purificação e análise de proteína recombinante LipoCAT-2 para a quantificação absoluta de apolipoproteínas em amostras biológicas

• Processo: 25/05110-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2025
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Graziella Eliza Ronsein
• Beneficiário: Vinicius Diniz Nassin
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): HDL-Colesterol Proteômica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Hdl | LipoCAT-2 | Performance Analítica | proteômica | QconCAT | Quantificação absoluta | Proteômica

Resumo

Conhecido na clínica médica simplificadamente como o bom colesterol, a HDL (lipoproteína de alta densidade, do inglês high-density lipoprotein) é constituída por uma coleção diversa de partículas, que variam em densidade, função e composição de lipídios e proteínas. Deste modo, a medida clínica utilizada hoje para medir as partículas de HDL na circulação - seu conteúdo de colesterol (HDL-C) - é incapaz de capturar sua complexidade composicional e funcional. O proteoma da HDL apresenta alterações em doenças imunes e cardiovasculares, e as proteínas alteradas podem ser utilizadas como biomarcadores de doenças. A quantificação precisa e acurada das proteínas é pré-requisito na procura e validação de biomarcadores. Contudo, a quantificação absoluta das proteínas da HDL ainda é um desafio. Uma estratégia viável é a utilização de uma proteína recombinante, sintetizada a partir da concatenação de peptídeos-alvo de diversas proteínas da HDL. Com esse intuito, desenhou-se em estudos prévios do nosso laboratório a proteína recombinante LipoCAT-1, composta por peptídeos das 53 proteínas mais comumente encontradas nas partículas de HDL. Após avaliação de sua performance analítica, alguns ajustes foram feitos à sua estrutura, dando origem à proteína recombinante aprimorada LipoCAT-2, que contém 48 peptídeos de proteínas importantes para a HDL, além de sequências de flanqueamento e dois sítios de purificação. No presente trabalho, a LipoCAT-2 será expressa em E. Coli DE3(BL21), purificada utilizando-se Cromatografia de Afinidade por Metal Imobilizado (IMAC), e o processo de purificação será monitorado por SDS-PAGE. Posteriormente, a LipoCAT-2 expressa em meio marcado (15N) será utilizada como padrão interno para a quantificação absoluta das proteínas da HDL, avaliando a sua performance analítica frente amostras biológicas, fazendo uso de proteômica acoplada à espectrometria de massas de alta resolução e monitorando parâmetros analíticos como limites de detecção e quantificação, linearidade, dentre outros. O projeto tem o potencial de fornecer um método de quantificação absoluta de proteínas da HDL em amostras clínicas, podendo contribuir para a identificação de biomarcadores e uma melhor compreensão da função da HDL em diversas condições patológicas. (AU)