Caracterização genotípica de cepas de Fonseca pedrosoi por RFLP

• Processo: 06/06361-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2007
• Data de Término da vigência: 07 de dezembro de 2007
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Farmácia
• Pesquisador responsável: Rosario Dominguez Crespo Hirata
• Beneficiário: Liliane Mayumi Yamamoto
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Doenças endêmicas Cromoblastomicose Polimorfismo de fragmento de restrição Fonsecaea pedrosoi Reação em cadeia por polimerase (PCR) Técnicas de laboratório clínico Técnicas de genotipagem Análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados Análise de sequência de DNA
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cromoblastomicose | Fonsecaea Pedrosoi | Genotipagem | Rflp | Análises Clínicas

Resumo

A cromoblastomicose é uma doença endêmica no Brasil, principalmente na zona rural, e é causada pela Fonsecaea pedrosoi e outros fungos demácios. Esses fungos apresentam significativo pleomorfismo o que pode dificultar a sua identificação. Recentemente desenvolvemos um método de PCR-duplex para detecção de F. pedrosoi util para a identificação de cepas com características morfologias inespecíficas ou mesmo detectar o agente diretamente em amostras biológicas. Outros métodos moleculares têm sido utilizados para a caracterização genotípica de cepas de fungos demácios para fins epidemiológicos e taxonômicos. O método de PCR-RFLP dirigido para a região genômica IT1-5.8S-ITS2-28S (ITS-RFLP) tem sido utilizado para detectar perfis de fragmentos de DNA caracteristicos (Fingerprinting) para diferenciação de espécies de fungos demácios. O presente estudo tem por objetivo a caracterização genotípica por RFLP de cepas de F. pedrosoi isoladas de pacientes com cromoblastomicose provenientes de diferentes regiões do Brasil. Também serão estudadas as relações entre os perfis de RFLP e as características fenotípicas em cepas isoladas durante o tratamento com itraconazol e os perfil de sensibilidade a antifúngicos in vitro. Serão estudadas cepas F. pedrosoi provenientes de diversas localidades do Brasil (n=40) e isoladas de pacientes em diferentes períodos de tratamento com itraconazol ou outros antifúngicos (n=40). Também serão avaliadas cepas de outros fungos demácios (n=20) com a finalidade de comparar os perfis de RFLP com o de F. pedrosoi. A identificação morfológica das cepas será realizada por técnica de microcultivo e o perfil de sensibilidade a antifúngicos será avaliado pelo método de microdiluição em caldo preconizado pelo NCCLS. O DNA genomico das cepas será extraído por método de extração com CTAB e a identificação molecular será realizada por PCR-duplex, métodos previamente otimizados no nosso laboratório. A caracterização genotípica das cepas será realizada por PCR-RFLP utilizando-se as enzimas de restrição DdeI e TaqI e os perfis diferentes serão também avaliados por sequenciamento de DNA. Os resultados deste estudo contribuirão para o conhecimento da diversidade genética de isolados de F. pedrosoi oriundos de diferentes regiões geográficas do Brasil e permitirá avaliar a sua relação com a variabilidade morfológica durante o tratamento com itraconazol in vivo e com o perfil de sensibilidade a antifúngicos in vitro.