Caracterização estrutural e funcional da Nucleosídeo Difosfato Kinase b (NDK-b) de Leishmania major

• Processo: 04/14912-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2005
• Data de Término da vigência: 22 de outubro de 2005
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Richard John Ward
• Beneficiário: Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira
• Instituição Sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cirstalografia De Raio X | Leishmania Major | Mutagenese Sitio Dirigida

Resumo

A enzima nucleosídeo difosfato kinase é uma enzima responsável pela produção de nucleosídeos trifosfatados e está envolvida com vários processos celulares. A NDK é secretada no meio extracelular e considerada um fator de patogenicidade em patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis e Vibrio cholerae. A NDK foi identificada na fração subcelular vesicular de Leishmania major, clonada e expressada em E. coli. O projeto tem como objetivo a caracterização estrutural e funcional da enzima nucleosídeo difosfato kinase b (NDK-b) recombinante de L. major que será purificada e caracterizada enzimaticamente. A estabilidade termodinâmica da enzima será estimada por estudos estruturais realizados com técnicas de fluorescência intrínseca do triptofano, dicroísmo circular e espalhamento dinâmico de luz. Mutações sítio dirigidas serão realizadas para a caracterização de mutantes e comparação com a proteína recombinante. Pretende-se cristalizar e resolver a estrutura tridimensional por raios-x de da NDK-b recombinante e dos mutantes. O estudo funcional da NDK será realizado com a transfecção e superexpressão da proteína e mutantes em formas promastigotas do parasita e análise da virulência em patas de camundongos e do perfil proteômico das formas transfectadas. A NDK-b será expressa em fusão com GFP será localizada por microscopia de fluorescência nas formas promastigotas transfectadas. (AU)