Vírus da febre amarela: diagnóstico, aspectos moleculares e interferência de rna

• Processo: 09/00485-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2009
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2009
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Biologia e Fisiologia dos Microorganismos
• Pesquisador responsável: Maurício Lacerda Nogueira
• Beneficiário: Daiane Cristina Machado
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). São José do Rio Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 04/11098-2 - Vírus da febre amarela: diagnóstico, aspectos moleculares e interferência de RNA, AP.JP
• Assunto(s): Virologia Interação proteína-proteína NS5 Febre amarela
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Febre amarela | Interação proteína-proteína | Ns5 | Virologia

Resumo

Esta solicitação destina-se a substituição de um bolsista que concluiu o curso de graduação. Terá a duração de 6 meses até o término do projeto JP. Será destinada a linha de pesquisa de interações proteína-proteína que tem tomado uma importância maior neste momento e com esta oportunidade gostaríamos de incluir mais um bolsista nesta linha. A candidata a esta bolsa tem sido estagiário com excelente desempenho e se juntaria com os outros 2 bolsistas IC para a conclusão deste projeto. Desta forma a bolsista atuaria em mais uma frente, sendo responsável em atuar em colaboração com mestrandos e doutorandos para caracterizar as interações entre NS5 e EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5 (INI). Plano de Atividades Este plano descreve as atividades que serão realizadas até o fim das atividades da bolsista em andamento e serão complementadas pela próxima bolsista. Cada uma das bolsistas de IC (3 neste projeto) trabalhará com uma proteína a ser definida após os processos de caracterização da interação in vitro. Ou seja, serão realizados experimentos de pull-down e co-imunoprecipitação com as proteínas EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5 (INI). Após estes experimentos cada bolsista trabalhará com uma proteína. Plano de Atividades Título: Análise de novas interações proteína-proteína entre NS5 de febre amarela e proteínas celulares Resumo e Objetivo Interações proteína-proteína são fenômenos essenciais para a regulação de diversos fenômenos biológicos. A replicação viral é essencialmente dependente da interação entre proteínas celulares e virais. Dados obtidos em nosso laboratório mostram que o domínio RNA polimerase da proteína NS5 de febre amarela interage com diversas proteínas celulares através de estudo de duplo híbrido. O objetivo deste trabalho é caracterizar a interação entre NS5 e proteínas celulares in vitro e in vivo. Plano de Trabalho incluindo Metodologia As proteínas identificadas no screening de duplo-híbrido e previamente selecionadas (EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5) serão caracterizadas para a sua interação com NS5 através de experimentos in vitro e in vivo. Para isto realizaremos: 1 - GST - pull down. A proteína NS5 expressada em bactéria na sua forma GST-tagged e formas His-tag de EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5 (também expressas em bactéria) serão utilizadas para pull down com colunas de afinidade para GST. A revelação da interação será feita por Western Blot. 2 - Co-imunoprecipitação As proteínas NS5 e seus parceiros serão expressos em células de eucarioto e co-imunoprecipitadas através de etiquetas HA e FLAG. A revelaçãos era realizada por western blot. 3 - Caracterização da interação entre as proteínas EIF6S3IP e SNF5 e o fragemnto de A de outros flavivírus O fragmento A correspondente de Dengue e SLE serão clonados em pGBKT7 e terá testada sua capacidade de interação com as proteínas EIF6S3IP e SNF5 através de duplo-híbrido. Caso positivo será também caracterizado através de GST-pul down. 4- Geração de mutantes e sua análise