Quantificação de formas promastigotas metacíclicas de Leishamania (L.) amazonensis em cultura

• Processo: 07/00077-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2007
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2007
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Fisiologia - Fisiologia Geral
• Pesquisador responsável: Lucile Maria Floeter-Winter
• Beneficiário: Rafaella Marino Lafraia
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Leishmania
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Diferenciacao De Leishmania | Infeccao | Metaciclogenese | Rt Pcr | Fisiologia de Tripanossomatídeos

Resumo

Formas promastigotas procíclicas (não infectivas) de organismos do gênero Leishmania, presentes no tubo digestório do hospedeiro invertebrado, ou mantidas em cultura in vitro, em resposta a estímulos externos passam a expressar diferentes genes diferenciando-se em formas promastigotas metacíclicas (infectivas). Um dos genes estágio-regulados, somente expresso nas formas metacíclicas, é o gene META1, cuja sequência é conservada entre as espécies de Leishmania. Mesmo sabendo que numa cultura in vitro a metaciclogênese ocorre em final de fase logarítmica – início de fase estacionária, e que portanto nessas fases esta cultura está enriquecida de matacíclicos, não é simples distinguir e quantificar essas formas. Por outro lado, saber a quantidade de parasitas infectivos em uma fase de cultura é extremamente importante quando se quer comparar capacidade infectiva entre diferentes linhagens. Tendo em vista essas informações, o objetivo do presente trabalho é padronizar um protocolo para quantificação de formas promastigotas metacíclicas de Leishmania (Leishmania) amazonensis presentes nas diferentes fases de uma curva de crescimento in vitro. Para atingir o objetivo proposto será realizada a quantificação de RNA mensageiro do gene META1 através de transcrição reversa seguida por PCR em tempo real a partir de RNA total extraído nas diferentes fases de cultura. Nessa quantificação, o gene que codifica a enzima arginase será utilizado como normalizador, uma vez que sabemos que sua expressão é constante em todas as fases da curva de crescimento de Leishmania. As amostras de RNA, obtidas em diferentes dias de cultura e convertidas em cDNA, serão quantificadas e o valor do número de cópias do alvo presente em cada ponto será determinado por comparação com uma curva padrão. Essa curva será traçada a partir de reações cujo número inicial de moléculas é conhecido. Essas moléculas serão obtidas por RT-PCR utilizando-se oligonucleotídeos complementares aos genes alvo, e o produto será clonado. Finalmente a padronização será calibrada a partir de culturas cuja porcentagem de promastigotas metacíclicos presentes tenha sido determinada por outra metodologia, podendo-se assim, estimar então a porcentagem de formas metacíclicos nas diferentes fases de crescimento. (AU)