Mutagênese sítio dirigida, expressão, purificação e obtenção de complexos protéicos de trxi e ctpxiii de saccharomyces cerevisiae

• Processo: 08/08587-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de janeiro de 2009
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2010
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
• Pesquisador responsável: Marcos Antonio de Oliveira
• Beneficiário: Vanessa Fernandes dos Santos
• Instituição Sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 07/50930-3 - Análise funcional e estrutural de proteínas antioxidantes dependentes de tióis: uma investigação de mecanismos moleculares de catálise e da formação de complexos protéicos contendo dissulfetos mistos, AP.JP
• Assunto(s): Saccharomyces cerevisiae Espécies de oxigênio reativas Biologia estrutural
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Complexos Proteicos | espécies reativas de oxigênio | Saccharomyces cerevisiae | Tiorredoxina peroxidásica citoplasmática 3 | Tiorredoxina 1 | Biologia Molecular Estrutural

Resumo

O estresse oxidativo por espécies reativas de oxigênio (EROs) pode acarretar danos em proteínas, lipídeos e DNA. Dentre as defesas antioxidantes, as tiorredoxinas peroxidases (TPx) tem sido intensamente estudadas, graças a sua grande representação e conservação por todos os filos e reinos. Estas proteínas são capazes de decompor H2O2 e peróxidos orgânicos utilizando cisteínas altamente reativas. A maior parte das TPx utiliza tiorredoxina (Trx), uma proteína de baixo peso molecular com duas cisteínas vicinais, como substrato redutor durante o ciclo catalítico. Adicionalmente à redução das TPxs, as Trxs estão envolvidas em diversos processos celulares distintos, como: crescimento celular, inibição de apoptose, ativação de transcrição e síntese de DNA, sendo, portanto, capaz de reduzir os mais variados substratos protéicos. A transferência de equivalentes redutores entre TPx-Trx ocorre por meio de pares de cisteínas presentes em seus sítios ativos e substituições de uma destas por serina pode levar à formação de complexos protéicos unidos por dissulfetos intermoleculares. Em Saccharomyces cerevisiae, foram identificadas cinco isoformas de TPx, sendo que três são encontradas no citoplasma (cTPx I, cTPx II, e cTPx III). Neste contexto cTPxIII se diferencia das demais por possuir uma afinidade por peróxidos orgânicos (ou peróxidos de lipídeos) 20 vezes superior e uma identidade de ~18% de sua estrutura primária com as outras TPx citosólicas. A ocorrência de peróxidos de lipídeos nas membranas celulares altera suas propriedades, modifica significativamente sua estrutura e é um processo extremamente deletério, sendo que sua redução é um processo fundamental para a sobrevivência do organismo. Apesar de diferenças estruturais aparentemente significativas, todas as TPx citosólicas de S. cerevisiae podem ser reduzidas por TrxI. Este projeto tem por objetivo contribuir para um melhor entendimento das relações estruturais entre cTPxIII e TrxI. Para tanto, serão realizadas mutações sítio dirigidas com o objetivo de efetuar a substituição C33 ®S33 de TrxI, e C120®S120 de cTPxIII, a expressão de proteínas recombinantes TrxIC33S e cTPxIIIC120S visando a obtenção de complexos protéicos contendo dissulfetos intra-moleculares estáveis entre TrxI-cTPxIII. A caracterização estrutural e funcional destas proteínas pode auxiliar em um melhor entendimento de seus mecanismos de oxirredução e de resíduos relacionados com reconhecimento e interação com substratos e as características estruturais envolvidas na formação e manutenção de complexos protéicos.