Síntese do gene do interferon alfa humano, clonagem e expressão em Escherichia coli

• Processo: 00/12581-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2001
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2003
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Ana Lucia Tabet Oller do Nascimento
• Beneficiário: Fernanda de Oliveira Neves
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Clonagem Expressão de proteínas Interferon alfa Escherichia coli
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Clonagem | Escherichia Coli | Expressao De Proteina | Interferon Alfa | Sintese De Gene

Resumo

O projeto tem como objetivo a síntese do gene que codifica para o interferon alfa humano, sua clonagem e expressão em E. coli. A síntese do gene será feita a partir de 25 oligonucleotídeos de -40 nt, que irão em conjunto formar o DNA dupla fita. Pretende-se sintetizar dois genes; um com a seqüência que corresponde ao interferon alfa 2b humano, e outro contendo a troca de dois resíduos (de cisteína para serina), na tentativa de obter uma molécula mais estável. Os genes sintéticos serão clonados no vetor pRSETA nos sítios de Bam Hl /Hind III e Ndel/Hind 111. Os plasmídeos contendo os insertos de DNA serão seqüenciados e clones contendo a sequência correta serão utilizados para transformar bactérias E. coli BL21(DE3), que contém o gene da T7 RNA polimerase. Os transformantes serão induzidos a expressar as proteínas recombinantes que conterão uma cauda de seis resíduos de histidinas N-terminal a proteína, no caso na clonagem em Bam Hl/Hind III e na ausência destes resíduos na clonagem nos sítios de restrição Ndel/Hind III. As proteínas recombinantes serão purificadas por cromatografia de afinidade e identificadas com antisoro específico anti-interferon alfa humano pelas técnicas de ELISA e Western blotting. A atividade biológica será avaliada no ensaio de inibição de efeito citopático de interfefons em fibrblastos desafiados com o vírus da estomatite vesicular (VSV). (AU)