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Clonagem e expressão do fragmento C da toxina tetânica em Pichia pastoris

Processo: 97/13972-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de março de 1998
Vigência (Término): 31 de agosto de 2000
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Ana Lucia Tabet Oller Do Nascimento
Beneficiário:Emília Yumi Tomita
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Clonagem   Expressão de proteínas   Leveduras   Toxina tetânica   Pichia pastoris

Resumo

O projeto propõe a clonagem do fragmento C da toxina tetânica na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Este hospedeiro tem sido descrito como bastante eficiente na produção de proteínas heterólogas, possuindo a vantagem de secretar a proteína expressa. A seqüência que corresponde ao fragmento C será obtida pela técnica da reação em cadeia da polimerase a partir do DNA genômico de Clostridium tetani como molde e oligonucleotídeos complementares a mesma. O inserto será sub-clonado no plasmídeo pGEM-llZf (sítios de restrição Bam HI e Not I) e posteriormente clonado no vetor pPIC9 (sítios Snab I e Not I), que é um 'shuttle vector' de Escherischia coli e Pichia pastoris. Clones positivos serão seqüenciados e um clone empregado para transformar a levedura Pichia pastoris, cepa GS 115, para estudos de expressão. A proteína recombinante (fragmento C) será analisada por eletroforese (PAGE-SDS) e Western blot. (AU)