Clonagem e expressão do fragmento C da toxina tetânica em Pichia pastoris

• Processo: 97/13972-6
• Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Vigência (Início): 01 de março de 1998
• Vigência (Término): 31 de agosto de 2000
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Ana Lucia Tabet Oller Do Nascimento
• Beneficiário: Emília Yumi Tomita
• Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Clonagem Expressão de proteínas Leveduras Toxina tetânica Pichia pastoris

Resumo

O projeto propõe a clonagem do fragmento C da toxina tetânica na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Este hospedeiro tem sido descrito como bastante eficiente na produção de proteínas heterólogas, possuindo a vantagem de secretar a proteína expressa. A seqüência que corresponde ao fragmento C será obtida pela técnica da reação em cadeia da polimerase a partir do DNA genômico de Clostridium tetani como molde e oligonucleotídeos complementares a mesma. O inserto será sub-clonado no plasmídeo pGEM-llZf (sítios de restrição Bam HI e Not I) e posteriormente clonado no vetor pPIC9 (sítios Snab I e Not I), que é um 'shuttle vector' de Escherischia coli e Pichia pastoris. Clones positivos serão seqüenciados e um clone empregado para transformar a levedura Pichia pastoris, cepa GS 115, para estudos de expressão. A proteína recombinante (fragmento C) será analisada por eletroforese (PAGE-SDS) e Western blot. (AU)