Prospecção toxicológica e farmacológica in vitro e in vivo de oleorresinas, extratos das folhas e compostos isolados de Copaifera oblongifolia Mart. ex Hayne e C. duckei Dwyer

Autor(es)

Marivane Lemos

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2016-08-26

Membros da banca

Jairo Kenupp Bastos; Sérgio Ricardo Ambrosio; Thiago Mattar Cunha; Luiz Alberto Beraldo de Moraes

• Orientador: Jairo Kenupp Bastos; Helen Sheridan

Resumo

Plantas medicinais são uma fonte rica na obtenção de moléculas com potencial terapêutico. No Brasil cerca de 40% da população utiliza plantas medicinais como alternativa terapêutica. Porém, grande parte das plantas nativas brasileiras não apresentam estudos científicos que comprovem a eficácia e a segurança. Além disso, devido à enorme biodiversidade, o número de espécies estudas ainda é pequeno, e representa um vasto campo a ser explorado. Neste contexto, as oleorresinas de planta do gênero Copaifera apresentam poucos estudos sob o ponto de vista químico, farmacológico e toxicológico. Suas partes aéreas, tais como folhas os estudos ainda são escassos. Dentro deste contexto, este projeto buscou avaliar a toxicologia de oleorresinas e extratos das folhas de C. oblongifolia Mart. ex Hayne e C. duckei Dwyer, e compreender preliminarmente os mecanismos envolvidos nos processos de citoproteção e cicatrização de úlceras gástricas, bem como os processos antiinflamatórios e antinociceptivos, atribuídos popularmente e previamente descritos na literatura para a oleorresina das copaíbas. Além disso, existem poucos estudos para C. oblongifolia Mart. ex Hayne e C. duckei Dwyer. Com base nos padrões de fragmentação obtidos nas análises em CG-MS e em UHPLC-(ESI)-HRMS permitiu concluir que as oleorresinas apresentam compostos da classe de sesquiterpenos e diterpenos, assim como descrito na literatura. Nos extratos das folhas foi possível observar a presença de flavonoides e derivados galoilquínicos, já descritos para as folhas da espécie, e epicatequinas, descrito na família Fabacea, mas não isolado ainda em espécies de Copaifera spp. Os resultados dos ensaios a atividade citotóxica em linhagens não neoplásicas (CHO-k1 e L929) e neoplásicas (AGS e THP-1) por meio do ensaio de viabilidade celular por fosfatase ácida, e no ensaio de morte celular determinada por iodeto de propídio em citometria de fluxo para as células AGS e THP- 1 demonstram que as oleorresinas, extratos e substâncias isoladas de C. oblongifolia e C. duckei apresentam atividade citotóxica preferencial em células neoplásicas, confirmando a atividade antitumoral já descrita na literatura. Na avaliação da toxicidade aguda por dose fixa, o extrato das folhas de C. oblongifolia, C. duckei e o ácido polialtico são seguros até a dose de 2000 mg/kg. A administração da oleorresina promove alterações hematológicas, bioquímicas e histológicas, principalmente ligadas ao metabolismo hepático, renal e pancreático. A oleorresina de C. duckei é tóxica na dose de 2000 mg/kg, promovendo a morte dos animais após 48 h da sua administração. No experimento com doses repetidas em 90 dias não houve morte dos animais tratados com 1, 10 e 100 mg/kg de oleorresina de C. duckei, porém houveram alterações hematológicas, bioquímicas e histológicas, embora menos evidente, no metabolismo hepático, renal e pancreático. Quanto a gastroproteção, as oleorresinas e os extratos das folhas de C. oblongifolia e C. duckei promovem efeitos citoproterores sobre a mucosa gástrica nos modelos de EtOH/HCl e AINEs. As frações em diclorometano e acetato de etila do extrato das folhas de ambas as espécies de Copaifera spp. contêm os compostos que podem ser responsáveis pela citoproteção gástrica. Sesquiterpenos, diterpenos, flavonoides e derivados galoilquínicos também foram avaliados, demonstrando atividades gastroprotetoras no modelo de úlceras induzidas por EtOH/HCl. Tanto a oleorresina quanto o extrato das folhas de C. xi oblongifolia e C. duckei apresentam atividade cicatrizante gástrica no modelo de úlceras induzidas por ácido acético, e aumentam a proliferação celular no ensaio de wound scratch em L929. A oleorresina de C. oblongifolia e C. duckei não contribui para o aumento do pH estomacal, mas diminuiu a quantidade de íons H+ secretada. Os extratos das folhas de C. oblongifolia e C. duckei aumentaram significativamente a quantidade de muco, favorecendo as defesas gástricas. A oleorresina e o extrato das folhas de C. oblongifolia são ativas contra a bactéria H. pylori, tanto in vitro, quanto in vivo. Os extratos de C. oblongifolia e C. duckei possuem maior atividade antioxidante - in vitro e in vivo - quando comparados à oleorresina. Em parte, os metabólitos presentes nas oleorresinas e nos extratos das folhas de C. oblongifolia e C. duckei promovem efeitos citoprotetores e cicatrizantes, interferindo na secreção de ácido, conforme demonstrado no ensaio sobre a enzima H+, K+-ATPase, aumentando a secreção de muco e favorecendo os mecanismos de defesa antioxidantes. Procurando verificar se a atividade antinociceptiva estava relacionada a ação no SNC dos animais, avaliaram-se as oleorresinas e os extratos das folhas das espécies de Copaifera spp. na função e coordenação motora dos animais, através dos testes de Open field e Rota rod. Nenhum tratamento interferiu na função e na coordenação motora dos animais. A oleorresina de C. duckei e sua substância majoritária, o ácido poliáltico foram testados quanto a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva, tanto sob o ponto de vista agudo, quanto crônico. Foram utilizados os métodos de contorções abdominais por ácido acético, nocicepção aguda por formalina, nocicepção térmica por tail-flick, hiperalgesia mecânica, edema de pata e air pouch (avaliação do exsudato na bolsa de ar) induzida por diversos agentes, tais como formalina, carragenina, dextrana, LPS e zymosan. Além disso, foram investigadas de forma preliminar as atividades contra dor crônica induzida por avulsão do plexo braquial (APB) e hipernocicepção induzida por CFA durante 15 dias. Em todos os ensaios houve redução tanto da resposta nociceptiva quanto da atividade inflamatória, sugerindo que há ação antinociceptiva a nível periférico, ou por inibição do sinal nociceptivo ou pela diminuição de mediadores que estimulam os nociceptores, que diminuir a migração celular e a concentração de mieloperoxidase (MPO) no local da lesão. Em células THP-1 estimuladas por LPS, os tratamentos com as oleorresinas, extratos e substâncias majoritárias de C. oblongifolia e C. duckei diminuíram os níveis de citocinas pró-inflamatórias INF-?, IL-1?, IL-6 e TNF-?. Os níveis de IL-10 foram parcialmente reduzidos com estes tratamentos. A ação sobre citocinas próinflamatórias sugere atividade anti-inflamatória tanto aguda quanto crônica, tendo em vista que o experimento possui os tempos de 24 h e 72 h e esta diminuição é dose dependente. Além disso, a oleorresina de C. duckei e o ácido poliáltico interferem nos níveis de NF-?B determinados no ensaio da luciferase. Estes resultados indicam que pode estar havendo interação com os receptores TLR4 e TLR2, que interferem na via do NF-?B e diminuem os eventos inflamatórios e apoptóticos oriundos desta via, confirmando as atividades estudadas. As atividades antinociceptivas e antiinflamatórias observadas no tratamento com a oleorresina de Copaifera spp. ou suas substâncias isoladas podem ser devido a diminuição da liberação ou síntese de mediadores relacionados à resposta inflamatória, que resulta em diminuição do estímulo nociceptivo. As atividades citotóxicas descritas indicam que existe potencial efeito antitumoral que justifica o estudo para o desenvolvimento de substâncias com atividade antitumoral, em especial atenção para os cânceres gástricos e ligados ao sistema imunológico, tendo em vista a seletividade citotóxica em linhagens tumorais AGS e THP-1. Os resultados apresentados neste trabalho são inéditos, tendo em vista que é escasso na literatura dados sobre a C. oblongifolia, e dados sobre o uso a longo xii prazo de oleorresinas e extratos de Copaifera. Além disso, os achados fitoquímicos sugerem que existe potencial investigação química, pois muitas substâncias ainda não foram isoladas das espécies. Ainda, estes resultados contribuem para a confirmação das atividades farmacológicas atribuídas popularmente para as espécies de Copaifera spp., sendo que pela primeira vez observou-se que a oleorresina é efetiva para o tratamento de doenças inflamatórias e dolorosas crônicas, tornado a planta alvo para o estudo mais aprofundado dos mecanismos de ação farmacológicos envolvidos, fornecendo subsídios para estudos posteriores que poderão servir ao desenvolvimento de um novo fitoterápico no Brasil. (AU)

• Processo FAPESP: 12/09727-8 - Prospecção toxicológica e farmacológica in vitro e in vivo de oleorresinas, extratos das folhas e compostos isolados de Copaifera oblongifolia Mart. ex Hayne e C. duckei Dwyer
• Beneficiário: Marivane Lemos
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado