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Estudos bioquímicos e estruturais da enzima glutaminase-2 (GLS2) de mamíferos

Autor(es):
Igor Monteze Ferreira
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
Data de defesa:
Membros da banca:
Daniela Barreto Barbosa Trivella; Paulo Sergio Lopes de Oliveira; Rafael Victorio Carvalho Guido; Artur Torres Cordeiro
Orientador: Andre Luis Berteli Ambrosio
Resumo

O câncer é uma doença que afeta milhões de pessoas no mundo a cada ano. A identificação de alvos terapêuticos para seu tratamento tem sido o assunto de extensa investigação. Atualmente, é bem estabelecido que os níveis metabólicos de células tumorais são adaptados para suportar as altas taxas de crescimento e a proliferação característica de tais células cancerosas; e uma característica comum neste contexto é o elevado consumo de glicose e glutamina. Glutaminases são enzimas multidomínios responsáveis pela reação inicial para a entrada de glutamina em vias catabólicas. Mamíferos possuem dois genes distintos para glutaminases, gls e gls2. Gls codifica para as isoformas, por splicing alternativo, KGA (Kidney-type glutaminase) e GAC (Glutaminase C), enquanto GLS2 codifica para as isoformas LGA (Liver-type glutaminase) e GAB (Glutaminase B), geradas por diferentes regiões de iniciação da transcrição. Coletivamente, KGA/GAC e LGA/GAB são normalmente referidas como GLS1 e GLS2, respectivamente. Este estudo concentra-se no entendimento dos mecanismos estruturais e catalíticos de GLS2, uma vez que recentemente esta tem sido relatada como importante para o crescimento e proliferação de tumores. Diversas construções de GLS2 humana foram produzidas para expressão heteróloga em sistemas bacteriano e de células de inseto. Uma construção que compreende o domínio de glutaminase foi cristalizada e a sua estrutura cristalina determinada por difração de raios X. Análise da estrutura sugere aminoácidos essenciais que podem ser responsáveis para os comportamentos cinéticos distintos entre GLS2 e GLS1. Em paralelo, estabelecemos um modo alostérico cooperativo de ativação para GLS2, como uma função de concentrações de enzima e substrato, bem como a presença do ativador fosfato inorgânico. Os coeficientes de Hill calculados demonstraram que o aumento da concentração de GLS2 nos ensaios culmina no crescimento da cooperação entre os monômeros, sugerindo ativação completa na forma de tetrâmeros. Análise complementares por gel-filtração analítica e microscopia eletrônica confirmam que GLS2 não se associa em oligômeros maiores do tetrâmeros - ao contrário de GLS1 - como função da concentração de proteína e presença de fosfato. Portanto, o aumento da cooperatividade, concomitante com o aumento da concentração GLS2, não afeta o número de monômeros no oligômero. Uma vez que as enzimas alostéricas frequentemente participam como reguladores chave de vias metabólicas, mediante a acumulo de outros metabolitos, testamos algumas diferentes moléculas como possíveis moduladoras de GLS2 e obtivemos que, além de fosfato inorgânico, citrato, AMP (adenosina monofosfato), glicose-6-P e frutose-6-P podem eventualmente ser ativadores GLS2 biologicamente relevantes, permitindo assim, a regulação cruzada entre as vias metabólicas distintas. Finalmente, através da resolução da inédita estrutura cristalográfica do motivo ankyrin na região de C-terminal GLS2, fomos capazes de propor um modelo molecular para a GLS2 em sua forma completa, usando restrições espaciais fornecidas por SAXS. No geral, esta coleção de resultados pode ser relevante para a futura concepção de inibidores de GLS2, podendo se tornar, assim, uma abordagem terapêutica complementar para os tumores que apresentam expressão e atividade de GLS2 aumentadas. (AU)

Processo FAPESP: 13/05668-0 - Entendendo os detalhes mecanísticos e funcionais da isoenzima Liver-type glutaminase (LGA/GLS2) de mamíferos
Beneficiário:Igor Monteze Ferreira
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto