Isolamento e purificação de uma neurotoxina crotoxina do veneno de Crotalus durissus cascavella: caracterização bioquimica e biologica / \ c Daniela Gois Beghini

Autor(es)

Daniela Gois Beghini

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2001-10-30

Membros da banca

Lea Rodrigues Simioni; Carmen Veríssima Ferreira

• Orientador: Sergio Marangoni

Resumo

A serpente Crotalus durissus cascavel/a é encontrada no cerrado do nordeste do Brasil (BARRA VI ERA, 1990) e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema de saúde pública (MARTINS et aI., 1998). A crotoxina é um complexo heterodimérico com atividade de fosfolipase A2 sendo o principal componente neurotóxico do veneno da Cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. A crotoxina atua bloqueando a transmissão de impulsos nervosos na junção neuromuscular causando uma paralisia flácida nas vítimas. O complexo crotoxina consiste em uma fosfolipase A2 (PLA2), componente básico, e um componente ácido, não enzimático conhecido como crotapotina. Acrotoxina do veneno de C. d. terrificus tem sido extensivamente estudada, enquanto que a crotoxina de outros venenos de Crotalus durissus sp tem sido pouco investigada.O objetivo deste trabalho foi a caracterização bioquímica e biológica do veneno e da crotoxina de Crotaus durissus cascavel/a, permitindo também um melhor entendimento do complexo crotoxina (PLA2 e crotapotina). PLA2 e crotapotina, foram purificadas através de dois passos cromatográficos: cromatografia de exclusão molecular em Superdex G-75 e cromatografia em HPLC de fase reversa. A análise cromatográfica em HPLC de fase reversa revelou quatro isoformas de crotapotina (F2, F3, F4 e F5) e apenas uma PLA2 (F6) na crotoxina do veneno de C. d. cascavel/a. A crotoxina de C. d. terrificus, ao contrário, contém três isoformas de PLA2 (Cdt F15, F16 e F17) e somente duas isoformas de crotapotina (Cdt F5 e F7). O grau de pureza das frações foi confirmado pela eletroforese em PAGE-SDS-Tricina onde mostrou que PLA2 e crotapotina migram como uma única banda com massa molecular estimada de 15 kDa e 9 kDa, respectivamente. A composição de aminoácidos da PLA2 mostrou uma grande quantidade de resíduos de meia-cisteína e um alto conteúdo de resíduos básicos, enquanto que as crotapotinas F3 e IF4 mostraram maior quantidade de resíduos carregados negativamente. Para uma melhor caracterização bioquímica avaliou-se a cinética da enzima PLA2 de C. d. cascavel/a. A PLA2 mostrou um comportamento alostérico, com atividade máxima em pH 8,3 e 35-40°C. A PLA2 de C. d. cascavel/a requer Ca2+ para exibir sua atividade, mas foi inibida por Zn2+ e CU2+. Crotapotina e heparina inibiram a atividade catalítica da enzima atuando como inibidores alostéricos. Com o objetivo de estudar a atividade biológica do veneno e da crotoxina de C. d. cascavel/a foi verificado a neurotoxicidade em preparação nervo frênico-diafragma de camundongo e preparação biventer cervicis de pintainho. O veneno de C. d. cascavel/a aqui reportado, bem como seu componente crotoxina, apresentou potente atividade neurotóxica, principalmente em preparação biventer cervicis de pintainho. O estudo miográfico, portanto, revelou que a preparação biventer cervicis de pintainho é mais sensível ao efeito paralisante do veneno e crotoxina quando comparada à preparação nervo frênico-diafragma de camundongo. A principal conclusão deste trabalho é que o veneno de C. d. cascavel/a contém pelo menos quatro isoformas de crotoxina formadas por diferentes combinações das crotapotinas com uma única isoforma de PLA2. Essa situação difere da crotoxina do veneno de C. d. terrificus, onde a heterogeneidade resulta da presença de três ou quatro isoformas de PLA2. Desde que a toxicidade do veneno depende principalmente de seu conteúdo de crotoxina, a presença das isoformas pode contribuir para variações na potência da neurotoxicidade (AU)

• Processo FAPESP: 99/10557-3 - Isolamento e purificação de uma neurotoxina crotoxina "like" do veneno de Crotalus durissus cascavella: caracterização bioquímica e biológica
• Beneficiário: Daniela Gois Beghini
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado