Purificação e caracterização do fator necrosante citotoxico do tipo 2 (CNF2) produzido por Escherichia coli

Autor(es)

Heloisa Helena Mithie Della Colleta

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 1997-10-24

Membros da banca

Tomomasa Yano; Domingos da Silva Leite; Antonio Jose Piantino Ferreira

• Orientador: Tomomasa Yano

Resumo

o Fator Necrosante Citotóxico do tipo 2 (CNF 2) foi obtido através do rompimento celular bacteriano por ultra-som. Após a extração, purificou-se o CNF 2 por precipitação com sulfato de amônia, cromatografia em resina de troca aniônica Q­ Sepharose Fast Flow e em resina de gel filtração molecular Superdex 200. A atividade específica do CNF 2 purificado foi de 2.925 e o grau de pureza do material aumentou em tomo de 8.000 vezes. Ensaios de caracterização sorológica foram realizados com antissoros de coelho e camundongo. Os antissoros produzido_ contra CNF 2 foram capazes de inibir o efeito citotóxico de CNF 1 e CNF 2, sendo. que o título neutralizante foi maior contra o seu homólogo. Os antissoros, porém, não inibiram as atividades biológicas de VT 1, VT 2 e L T I. Em ensaios de imunodifusão radial, os antissoros reconheceram tanto CNF 1 como CNF 2, apresentando identidade parcial entre eles. Quando o antissoro foi absorvido com extrato sonicado de CNF 1, este passou a não mais reconhecer CNF 1. Nos ensaios de ELIS_ "wersten-blot" e "dot-ELISA" os antissoros não se mostraram específicos, reconhecendo além de CNF 2, CNF 1, VT 1, VT 2 e L T I. Foram realizados ensaios de caracterização do efeito biológico de CNF 2, que revelaram que esta toxina foi capaz de causar necrose em pele de coelho e em pata de camundongo. O efeito de multinucleação celular foi observado em células Vero e em células HeLa, sendo que em células Vero este efeito foi mais claramente observado; nas células HeLa foi possível observar aumento de células multinuc1eadas, que já eram observadas nos controles. Foi possível observar também, que a toxina leva ao acúmulo de RNA nos núcleos e à formação de grandes vacúolos ao redor do núcleo. Em ensaios de marcação dos componentes do citoesqueleto, foi possível verificar que, após 8 horas de tratamento com CNF 2, as células apresentam alterações dos filamentos de actina, com formação de fibras de estresse. Esse efeito aumenta conforme o teste é prolongado. Quanto aos microtúbulos, não foram observadas alterações claras. Parece ocorrer apenas uma adaptação destes filamentos à presença de mais de um núcleo. o estudo epidemiológico revelou que havia produção de CNF em 19,05% das amostras isoladas de fezes de bezerros e que, das amostras produtoras de CNF, 30,77% produziram também et.-hemolisina (AU)

• Processo FAPESP: 94/01746-3 - Producao de imuno-reagentes para o diagnostico dos fatores necrosantes citotoxicos (cnf1 e cnf2) de escherichia coli de origem animal.
• Beneficiário: Heloisa Helena Mithie Della Colleta
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado