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Expressão heteróloga de celulases de Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 em Pichia pastoris e Escherichia coli com a caracterização e purificação das enzimas produzidas

Texto completo
Autor(es):
Carolina Bezerra Bussoli
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas.
Data de defesa:
Membros da banca:
Adalberto Pessoa Junior; Mario Tyago Murakami; Gustavo O. Bonilla Rodriguez; Aliandra Maura Gibertoni Malaman
Orientador: Eleni Gomes
Resumo

Os microrganismos termofilicos são de grande interesse biotecnológico, não apenas por tolerar altas temperaturas, mas também por secretarem proteínas de maior estabilidade, com características bioquímicas e estruturais importantes de múltiplas aplicações na indústria. A linhagem do fungo termofílico Myceliophthora heterothallica F.2.1.4, isolada de camas de frango, apresentou alta atividade da enzima β-1,4-endoglucanase (31 U/ml). O gene codificante da β-1,4-endoglucanase de F.2.1.4 foi identificado e expresso em leveduras Pichia pastoris e em bactéria Escherichia coli. A caracterização do gene permitiu identificar esta enzima como membro da família glicosídeo hidrolase 5 (GH5), nomeada neste estudo como Mh_GH5. A enzima apresenta na região N-terminal um módulo de ligação ao substrato (CBM) pertencente a família 1. As enzimas expressas em P. pastoris e em E. coli foram purificadas e submetidas à caracterização bioquímica. A caracterização bioquímica demonstrou que as enzimas recombinantes apresentaram ótimos de temperatura de 55°C (P. pastoris) e 60°C (E. coli) e pH ótimo de 4,0 para ambos os sistemas heterólogos. A análise da estabilidade das enzimas demonstrou que as enzimas expressas por Pichia pastoris apresentaram-se estáveis em temperaturas mais elevadas (70°C), indicando que a glicosilação teria papel essencial na termoestabilidade de enzimas recombinantes. A determinação estrutural em alta resolução foi realizada para o domínio catalítico desta nova β-1,4-endoglucanase GH5 de M. heterothallica expressa em E. coli. A estrutura foi determinada à 1.1 Å e apresenta uma arquitetura frequentemente encontrada dentre os membros da família de GH5, (β/α)8 TIMbarrel. Os dados obtidos neste estudo podem contribuir para a determinação de características envolvidas na termoestabilidade de enzimas provenientes de... (AU)

Processo FAPESP: 12/00506-9 - Expressão heteróloga de celulases de Myceliophthora heterotalica F.2.1.4 em levedura Pichia Pastoris com a caracterização e purificação das enzimas produzidas
Beneficiário:Carolina Bezerra Bussoli
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado