Expressão heteróloga de celulases de Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 em Pichia pastoris e Escherichia coli com a caracterização e purificação das enzimas produzidas

Autor(es)

Carolina Bezerra Bussoli

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São José do Rio Preto. 2016-06-30.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas. São José do Rio Preto
• Data de defesa: 2016-05-20
• Orientador: Eleni Gomes

Resumo

Os microrganismos termofilicos são de grande interesse biotecnológico, não apenas por tolerar altas temperaturas, mas também por secretarem proteínas de maior estabilidade, com características bioquímicas e estruturais importantes de múltiplas aplicações na indústria. A linhagem do fungo termofílico Myceliophthora heterothallica F.2.1.4, isolada de camas de frango, apresentou alta atividade da enzima β-1,4-endoglucanase (31 U/ml). O gene codificante da β-1,4-endoglucanase de F.2.1.4 foi identificado e expresso em leveduras Pichia pastoris e em bactéria Escherichia coli. A caracterização do gene permitiu identificar esta enzima como membro da família glicosídeo hidrolase 5 (GH5), nomeada neste estudo como Mh_GH5. A enzima apresenta na região N-terminal um módulo de ligação ao substrato (CBM) pertencente a família 1. As enzimas expressas em P. pastoris e em E. coli foram purificadas e submetidas à caracterização bioquímica. A caracterização bioquímica demonstrou que as enzimas recombinantes apresentaram ótimos de temperatura de 55°C (P. pastoris) e 60°C (E. coli) e pH ótimo de 4,0 para ambos os sistemas heterólogos. A análise da estabilidade das enzimas demonstrou que as enzimas expressas por Pichia pastoris apresentaram-se estáveis em temperaturas mais elevadas (70°C), indicando que a glicosilação teria papel essencial na termoestabilidade de enzimas recombinantes. A determinação estrutural em alta resolução foi realizada para o domínio catalítico desta nova β-1,4-endoglucanase GH5 de M. heterothallica expressa em E. coli. A estrutura foi determinada à 1.1 Å e apresenta uma arquitetura frequentemente encontrada dentre os membros da família de GH5, (β/α)8 TIMbarrel. Os dados obtidos neste estudo podem contribuir para a determinação de características envolvidas na termoestabilidade de enzimas provenientes de organismos termofílicos e, consequentemente na obtenção de biocatalisadores eficientes na conversão da biomassa lignocelulósica em biocombustíveis ou compostos químicos biossintetizados. (AU)

• Processo FAPESP: 12/00506-9 - Expressão heteróloga de celulases de Myceliophthora heterotalica F.2.1.4 em levedura Pichia pastoris com a caracterização e purificação das enzimas produzidas
• Beneficiário: Carolina Bezerra Bussoli
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado