Desenvolvimento de sonda fluorescente para a determinação específica da atividade halogenante das enzimas mieloperoxidase e peroxidase de eosinófilos

Autor(es)

Luiza de Carvalho Bertozo

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Bauru. 2017-03-16.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Faculdade de Ciências. Bauru
• Data de defesa: 2017-02-23
• Orientador: Valdecir Farias Ximenes

Resumo

A enzima mieloperoxidase (MPO), proveniente dos neutrófilos e monócitos, é capaz de catalisar a oxidação de íons Cl- e Br- a partir da redução do peróxido de hidrogênio. Os oxidantes formados, ácido hipocloroso (HOCl) e ácido hipobromoso (HOBr) são intensamente reativos e atuam como agentes bactericidas, podendo estar envolvidos em processos deletérios que caracterizam doenças de cunho inflamatório. A determinação da atividade halogenante específica da MPO não é trivial, pois devido ao alto potencial redox da forma ativa composto I (1,16 V), além de Cl- e Br-, ela é capaz de catalisar a oxidação de vários compostos orgânicos pelo mecanismo peroxidásico. Assim, são poucas as metodologias utilizadas até o momento que medem exclusivamente a atividade halogenante. Neste trabalho desenvolvemos uma metodologia para a determinação da atividade halogenante da MPO utilizando a sonda fluorescente dansilglicina (DG), a qual se mostrou insensível a ação peroxidásica da enzima, mas susceptível ao ataque eletrofílico dos ácidos HOCl e HOBr. Os estudos de cinética rápida mostram que a velocidade de reação entre a DG e o HOCl aumenta com a adição de Br-. Foi possível verificar a queda linear na intensidade de fluorescência da DG quando concentrações crescentes de HOCl foram adicionadas ao meio reacional juntamente com uma concentração fixa de Br-. Os mesmos resultados foram obtidos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e, quando acoplado ao espectrômetro de massas, foi possível identificar o produto da reação, o composto bromossubstituído da DG. Os estudos utilizando a enzima MPO comprovaram a especificidade da metodologia, visto que a queda de fluorescência na ausência de Cl- e Br- foi mínima. A peroxidase de eosinófilos tambem é capaz de catalisar a oxidação de haletos, produzindo principalmente o HOBr. Desta maneira, ao aplicar a metodologia da DG na determinação da atividade halogenante da EPO, a produção de HOCl/HOBr tambem pode ser analisada. Posteriormente, ao utilizar a metodologia da DG, em estudos com inibidores, foi possível distinguir o mecanismo de um inibidor reversível do mecanismo de um inibidor irreversível, em estudos realizados para a MPO e para a EPO. Concluímos que o método baseado na queda de fluorescência da DG possui grande potencial como técnica para detecção direta e específica da atividade halogenante das enzimas MPO e EPO. (AU)

• Processo FAPESP: 15/08267-1 - Desenvolvimento de sonda fluorescente para determinação específica da atividade halogenante das enzimas mieloperoxidase e peroxidase de eosinófilos
• Beneficiário: Luiza de Carvalho Bertozo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado