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Bioinformática e biogeografia para buscar produtos naturais em metagenomas

Texto completo
Autor(es):
Ulysses Amâncio de Frias
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Imprenta: Ribeirão Preto.
Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
Data de defesa:
Membros da banca:
Monica Tallarico Pupo; Hosana Maria Debonsi; Luciana Gonzaga de Oliveira; Nelilma Correia Romeiro; José Freire da Silva Neto
Orientador: Monica Tallarico Pupo
Resumo

Os produtos naturais microbianos (NP) tem demonstrado ser inestimáveis pontos de partida na descoberta e desenvolvimento de medicamentos aprovados pelo FDA. A abordagem tradicional para a identificação de produtos naturais microbianos exige a cultura em laboratório. Infelizmente, os métodos convencionais baseados nesta metodologia foram desestimulados devido a altas taxas de redescoberta de moléculas. Os métodos independentes de cultura que se baseiam no sequenciamento do metagenoma microbiano sugerem a ocorrência de um enorme reservatório inexplorado de clusters biossintéticos de produtos naturais (BGCs) no meio ambiente. Neste trabalho utilizamos uma metodologia baseada em PCR e barcoding amplicon-sequencing para buscar importantes famílias de produtos naturais como peptídeos não ribossomais (NRP), ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico (AHBA), dímeros de triptofano (TD), policetídeos, aminoglicosídeos e outros. Para isto desenvolvemos um script chamado SecMetPrimer que nos permitiu bioinformaticamente desenhar conjuntos de primers contendo um gradiente de degenerâncias. No total, desenhamos 165 conjuntos de primers. Os amplicons foram obtidos por PCR padrão, tendo sido concatenados barcodes específicos por amostra e sequenciados através de Illumina MiSeq. Para validar, utilizamos eDNA (environmental DNA) de bibliotecas metagenômicas, totalizando 223 milhões de clones. Através das análises bioinformáticas, as curvas de rarefação foram calculadas e a diversidade para cada família foi determinada. Foi realizada uma reamplificação dos domínios de adenilação de peptídeo não ribossomal e domínios de cetosintase de policetídeos utilizando eDNA isolado de 25 amostras diferentes coletadas em Mata Atlântica, Cerrado e ambiente marinho. Nossos dados indicaram a correlação entre distância geográfica e o tipo ecológico dos biomas. Deste modo, foi possível assim atribuir genes relacionados à clusters biossintéticos que codificam importantes produtos naturais à informações taxonômicas e metabólicas. Deste modo identificamos os melhores hotspots para busca de diversidade biossintética dentre as amostras analisadas. (AU)