Caracterização estrutural e funcional de proteínas de membrana envolvidas na síntese do peptideoglicano

Autor(es)

Lucas Mayrink Assis

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2017-07-26

Membros da banca

Andréa Dessen; Aline Mara dos Santos; Andre Luís Berteli Ambrosio; Juliana Helena Costa Smetana; Juliana Ferreira de Oliveira

• Orientador: Andréa Dessen

Resumo

A parede celular desempenha uma função essencial na manutenção da sobrevivência bacteriana, prevenindo a lise osmótica e conferindo rigidez e formato à célula. As enzimas envolvidas na biossíntese de seu componente central, o peptideoglicano, são potenciais alvos para novos fármacos. Além disto, a maior parte desta via metabólica é bem caracterizada estrutural e funcionalmente. Uma das exceções consiste na etapa de translocação do substrato precursor lipídeo II. As proteínas que medeiam essa atividade celular são chamadas, genericamente, de flippases. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi a caracterização estrutural e funcional da proteína RodA, uma proteína de membrana, com papel de flippase, e que participa dos processos de translocação do lipídeo II no alongamento celular, sendo parte do complexo multiproteico denominado de elongasome. Adicionalmente, este estudo também abordou o entendimento estrutural das proteínas quiméricas (Flippase-PBPs), que contêm tanto a função enzimática da flippase quanto a função enzimática da Penicillin Binding Protein (PBP). A maior parte deste trabalho de doutoramento foi realizada no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), Campinas- SP, contudo, uma parte do estudo foi realizado no Institut de Biologie Structurale (IBS), em Grenoble, na França. Nossa abordagem experimental consistiu na expressão das proteínas em sistemas de expressão bacterianos e do tipo cell-free, na purificação e seleção dos detergentes apropriados para a solubilização das proteínas de membrana, na caracterização hidrodinâmica por ultra centrifugação analítica (AUC) e espalhamento de luz dinâmico (DLS), na cristalização (in surfo e in cubo) e na caracterização da atividade enzimática da RodA em relação à atividade de flippase e de GTase. Os resultados obtidos mostraram a eficiência do cell-free em expressar as proteínas e, adicionalmente, mostraram que este tipo de sistema acarreta em protocolos de purificação mais simples quando comparados a protocolos desenvolvidos com base em sistemas bacterianos de expressão. A caracterização da Flippase-PBP complexada com detergentes mostrou que ela é monomérica e estimou, numericamente, seu raio hidrodinâmico e seu quociente friccional. A cristalização in cubo foi implementada como técnica principal de cristalização e ensaios iniciais foram realizados com a RodA e com a Flippase-PBP. Os resultados da caracterização funcional da RodA (E. coli e B. subtilis) serão publicados em breve e demonstraram a ação enzimática desta proteína no que tange à translocação do lipídeo II e à ação catalítica de transglicosilação (AU)

• Processo FAPESP: 13/22681-0 - Caracterização estrutural de complexos membranários envolvidos na síntese da parede celular bacteriana
• Beneficiário: Lucas Mayrink Assis
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto